H12、RS13和RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表达研究

袁秀秀 王煜

卵巢是雌性动物的重要性腺器官,主要有生殖和内分泌两大功能,卵巢周期性变化受多种因素调控。卵巢功能在维持雌性动物的生育能力中起重要作用。近年随着生活水平和女性受教育程度提高,因卵巢功能减退导致女性不孕率逐年升高,研究影响卵巢功能减退的分子机制尤为重要。miRNAs是真核生物中表达保守的小分子非编码RNA,通过与特定mRNA非翻译区结合,在转录后水平调控基因的表达,参与调控机体的生理病理进程,与疾病的发生发展密切相关。多项研究证实卵巢中功能性miRNA在调控卵巢发育中起关键作用[1-2]。课题组前期发现妊娠早期蜕膜中的miRNA差异表达谱[3]。miR-199在调控眼睛发育中起重要作用[4],miR-199b-5p是否也参与调控卵巢发育及相关分子调控机制不清。本课题组前期研究中发现miR-199b-5p基因敲除雌性小鼠繁殖能力较野生型小鼠低,前期质谱技术检测发现敲除型和野生型小鼠卵巢中存在差异蛋白,本研究从中筛选出与DNA损伤修复、细胞增殖、凋亡和卵泡成熟等密切相关的三个基因(H12、RS13、RL6)进行实验验证。

材料与方法

一、材料

1.小鼠饲养:miR-199b-5p基因敲除小鼠由课题组在北京唯尚立拓科技有限公司提供的miR-199b-5p基因敲除模型鼠自行繁育获得;对照实验用野生型C57BL/6小鼠。小鼠饲养于SPF级屏障区。

2.组织取材:用颈椎脱臼法处死性成熟期(约11～12周)雌性小鼠,留取卵巢和脾组织,放置-80 ℃冰箱冻存,用于后续实验。

3.主要实验用试剂与仪器:基因组DNA提取试剂盒(DP304-02 天根生化科技有限公司),核酸染料(RT210 天根生化科技有限公司),AGAROSE G-10(111860),DNA Marker I分子量标准(MD101-01 天根生化科技有限公司),PCR MasterMix(PC1120 索莱宝),HiScrip III RT SuperMix for Qpcr(R323-01 雅酶),ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix(Q711-02 雅酶),高效RIPA组织/细胞裂解液(R0010 索莱宝),RHOA Rabbit Polyclonal antibody(10749-1-AP),RPS13 Rabbit Polyclonal antibody(16680-1-AP),RPL6 Rabbit Polyclonal antibody(15387-1-AP),ChamQ Universal SYBR qPCR Master mix(Q711-02 雅酶),5×蛋白上样缓冲液(P1040 索莱宝),彩色预染中分子蛋白质分子量标准(AR1113 武汉博士德生物工程有限公司),NcmECL Ultra(P103008A和P103008B 新赛美生物科技有限公司),普通PCR仪 Analytikjena-FlexCycler Block assembly T48,超微量分光光度计 Thermo NanoDrop2000,实时荧光定量PCR仪 Applied Biosystems StepOne Plus,全自动凝胶成像分析系统 ChampGel5000,全波长酶标仪 Thermo Fisher Multiskan GO-1510,电泳及转膜仪 Bio-Rad Mini-PROTEAN/Min-Trans-Blot,Western 化学发光成像仪 UVP-BioLiteTMXeMultiSpectral Light Source。

二、方法

1. 实验方法:PCR法对小鼠基因型进行鉴定,观察miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育能力,qPCR 检测H12、RS13和RL6基因在小鼠卵巢中的mRNA表达水平,Western blot 检测H12、RS13和RL6在小鼠卵巢中的蛋白表达水平。

(1)小鼠基因型鉴定:取鼠脾组织约8-10mg,用DNA提取试剂盒提取组织DNA。用逆转录试剂盒逆转录,反应条件:94℃ 3min,94℃ 30s→56.4℃ 30s → 72℃ 30s(共30循环),72℃ 5min。转录产物进行琼脂糖凝胶电泳,用1 × TBE buffer 70 mL,加入琼脂糖 0. 7 g 及 7 μl 的核酸染料制胶,取上述 PCR 扩增产物 10 μl,电压 110 V,电泳50 min,于全自动数码凝胶图像分析系统中拍照观察。根据PCR产物片段大小区分野生型和敲除型小鼠。引物见表1。

表1 引物名称及序列Table 1 Name of Primer and it′s sequences

(2)观察miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育能力:选取同批繁育出的KO组和WT组雌鼠,待其性成熟后,与经验证有生育能力的成年雄鼠合笼(KO 组♀+KO组♂,WT 组♀+WT组♂)。连续观察6个月,记录两组鼠的产仔情况(每窝的产仔个数),分析KO组雌性小鼠的生育能力是否受影响。

(3)qPCR 检测H12、RS13和RL6基因在小鼠卵巢中的mRNA表达水平:用RNA裂解液提取卵巢组织中的总RNA并测定纯度和浓度。按照逆转录试剂盒逆转录。用Q711-03荧光定量PCR试剂盒进行定量PCR,配制反应体系20 uL:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10uL、Primer1(10uM)0.5uL、Primer2(10uM)0.5uL、Template DNA 1 uL、ddH2O 8 uL。反应条件:预变性95 ℃ 30 s,循环反应95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 共40个循环,溶解曲线 95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。在实时荧光定量PCR仪 Applied Biosystems StepOne Plus中进行qPCR和结果分析。每个样本做复孔,以GAPDH为内参基因,2-ΔΔCt法计算目的基因的相对mRNA表达水平。引物见表1。

(4)Western blot 检测H12、RS13和RL6在小鼠卵巢中的蛋白表达水平:用RIPA裂解液和PMSF(100:1)冰上裂解卵巢组织,离心取上清,提取蛋白。将蛋白加入5×蛋白上样缓冲液(5倍稀释),混匀后沸水煮沸10 min使其变性。变性好的蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜至PVDF膜上,用5%的脱脂牛奶封闭1.5 h,TBST溶液洗膜。4 ℃孵育一抗RHOA Rabbit Polyclonal antibody(1:500);RPS13 Rabbit Polyclonal antibody(1:1 000);RPL6 Rabbit Polyclonal antibody(1:2 000)过夜。洗膜后室温摇床上孵育二抗(1:5 000)1小时。ECL发光试剂显影,以GAPDH为内参对照,ImageJ软件进行灰度分析。

2. 统计学处理:应用 SPSS 25.0软件进行统计分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示。两组间比较先进行正态性和方差齐性检验,两组资料符合正态,如方差齐用t检验,方差不齐用非参检验;两组资料不符合正态,用非参检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、敲除型鼠模型稳定遗传

根据下面三种情况判断敲除基因鼠为野生型、杂合子、纯合子:(1)野生型小鼠:PCR结果为一条带,大小为348 bp。(2)纯合子小鼠:PCR结果为一条带,大小为214 bp。(3)杂合子小鼠:PCR结果为两条带,一条大小为348 bp、一条大小为214 bp。实验结果显示23只敲除型鼠为miR-199b-5p基因敲除鼠,与饲养时分组一致,表示基因敲除鼠稳定遗传。

图1 琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis

二、miR-199b-5p基因敲除雌鼠生育力下降

统计两组雌鼠的生育情况半年,共观察WT组生产27窝,平均产仔数为(8.15±0.41)只;KO组生产28窝,平均产仔数为(6.43±0.32)只。敲除型雌鼠生育力较野生型雌鼠明显下降(见图2)。

图2 两组雌鼠产仔数比较Figure 2 Comparison of litter size between the two groups

三、miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的mRNA表达水平上调

qPCR法检测结果显示KO组卵巢组织中H12、RS13、RL6显著高于WT组(见图3)。

图3 qPCR检测H12、RS13、RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的mRNA表达水平(n=10)Figure 3 mRNA expression levels of H12、RS13 and RL6 in the ovaries of miR-199b-5p knockout mice were detected by qPCR(n=10)

四、miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的蛋白差异表达

WB检测结果显示与WT组比较,KO组小鼠卵巢组织中H12显著上调,而RS13、RL6显著下调(见图4)。

图4 WB检测H12、RS13、RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的蛋白表达水平(n=3)Figure 4 Protein expression levels of H12, RS13 and RL6 in the ovaries of Mir-199b-5p knockout mice were detected by WB(n=3)

讨 论

近年来随着生活水平和女性受教育程度不断提高,晚婚晚育女性数量渐增, 卵巢储备功能低下(diminished ovarian reserve, DOR)的发生率呈上升趋势[5]。而中国三孩政策开放,高龄妇女生育需求增加,DOR的早期预防、诊断和治疗成为生殖医学的热点话题。但是迄今DOR病因不明,可能与年龄、环境、遗传、免疫、手术、药物、不良生活方式、心理压力等因素密切相关,故从机制上探讨DOR的发病机制非常必要。近几年研究发现,miRNA广泛参与多种疾病的发生和发展过程,对疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。miR-199家族与肿瘤发生密切相关,其中miR-199b-5p在调控细胞增殖、凋亡及细胞发育中起关键作用。有研究在多囊卵巢综合征患者卵泡液中发现差异表达的miR-199b-5p,且相关分析发现miR-199b-5p与AMH呈负相关[6]。此外,miR-199b-5p可以抑制卵巢癌细胞的增殖[7]。本研究通过构建miR-199b-5p敲除雌性小鼠模型,观察该模型雌性小鼠繁殖情况发现miR-199b-5p敲除可使雌性小鼠的繁殖能力下降,这与课题组前期实验发现miR-199b-5p敲除小鼠胚胎种植率下降结果相呼应,提示miR-199b-5p可能影响小鼠卵巢储备能力,这与国内研究者用高通量测序技术检测发现POF患者卵巢中miR-199b-5p表达下调结果类似[8]。

由此可见,miR-199b-5p下调可能与卵巢功能下降密切相关。鉴于此,本研究从DNA损伤、细胞增殖、凋亡等影响细胞衰老的角度出发,探讨miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中是否有加速细胞衰老的进程。组蛋白H12做为细胞凋亡的信号分子,是连接组蛋白H1的重要变体,位于6号染色体。在果蝇卵巢中的生殖系干细胞(germline stem cells,GSCs),H1丢失导致其通过激活关键的GSC分化因子Bam过早分化,转录激活因子MOF的过表达会抑制染色质上的 H1 结合,提示H1在GSC自我更新的调节中具有关键调节功能[9]。在DNA双链断裂损伤时,H12快速从染色质损伤位点脱落,并进一步被蛋白酶体降解,提示H12是DNA 损伤修复所必需的[10]。有研究报道当DNA损伤时,组蛋白H1从细胞核转移到细胞质中,靶向作用于线粒体融合蛋白Mfn,引起细胞内源性的凋亡[11]。可见H12与DNA损伤修复、细胞凋亡密切相关。本研究显示在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中H12基因表达升高,推测miR-199b-5p下调可能影响DNA损伤修复及细胞凋亡过程,进而导致卵巢储备能力下降。

核糖体蛋白在核糖体外发挥调控细胞增殖、分化、凋亡、基因转录等功能。其中核糖体蛋白S13在果蝇生殖干细胞的自我更新和分化中是必需的,有研究证实RS13调控睾丸细胞增殖和凋亡[12]。生物信息学分析山羊卵巢中差异表达的mRNA,发现RL12、RS13 和 RL10 mRNA在卵巢卵泡期高表达,认为这些mRNA与卵母细胞的生长和成熟有关[13]。可见RS13基因与细胞增殖、凋亡、卵泡成熟过程有关。本研究显示,miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中RS13表达异常,推测miR-199b-5p下调可能影响卵巢细胞的增殖、凋亡或卵泡成熟等过程,进而导致卵巢储备能力下降。研究发现,下调核糖体蛋白L6能抑制前列腺癌细胞增殖及侵袭能力, 促进细胞凋亡[14]。有报道RL6直接与组蛋白 H2A 相互作用参与 DNA 损伤反应,敲低RL6 导致 DNA 损伤诱导的DNA 损伤修复缺陷,证实 RL6为参与DNA损伤反应的关键调节因素[15]。可见RL6基因与细胞凋亡和DNA损伤修复有关。本研究显示,miR-199b-5p敲除小鼠卵巢组织中的RL6表达异常,推测miR-199b-5p下调可能导致DNA损伤修复缺陷或细胞凋亡,进而导致卵巢储备能力下降。H12、RS13、RL6这三个基因与卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、卵泡成熟密切相关。目前这些基因表达异常与DOR的关系鲜少有研究报道。我们发现,在miR-199b-5p基因敲除模型小鼠卵巢中存在H12、RS13、RL6蛋白的差异表达,这与前期蛋白质谱检测发现的差异蛋白结果相符。综上所述,miR-199b-5p敲除小鼠生育力下降可能与H12、RS13、RL6蛋白差异表达有关,这些基因的表达异常可能抑制DNA损伤修复、细胞增殖,促进细胞凋亡等过程影响卵巢发育,加速卵巢细胞衰老促使DOR的发生发展。后续将进一步在体外水平研究miR-199b-5p与H12、RS13、RL6的作用关系及对细胞表型的影响,探讨miR-199b-5p在卵巢储备能力低下中的分子机制。