基于灰色关联分析的荜茇体外抗氧化活性谱效关系研究

2024-01-16 03:19张慧文张莎莎宋晓玲李俊利孙丽君白云霞
食品与药品 2023年6期
关键词:极性胰岛关联度

张 弘,张慧文,张莎莎,宋晓玲,梁 越,李俊利,孙丽君,白云霞*

(1.内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010110;2.鄂尔多斯市中心医院 中心实验室,内蒙古 鄂尔多斯 017000;3.包头医学院,内蒙古 包头 014040;4.内蒙古自治区人民医院,内蒙古 呼和浩特 010017)

荜茇是胡椒科胡椒属植物荜茇(PiperlongumL.)的干燥未成熟或成熟果穗,主产于印度、菲律宾等地,在我国多地均有栽培,是中、蒙、藏、维医等的习用药材[1]。现代医学研究表明荜茇具有良好的抗氧化、调节糖代谢和保护胃黏膜等多种药理活性。现代研究表明,荜茇有效成分为酰胺类生物碱[2]成分,如荜茇宁(piperlonguminine)、胡椒碱(piperine)、pipernonaline、dehydropipernonaline、几内亚胡椒碱(guineensine)等。

有学者对荜茇的质量控制做过研究,但由于标准物质的缺乏,多是基于胡椒碱含量检测的质量控制方法,同时缺乏与活性的相关性分析,无法全面反映药材的质量。谱效关系研究通过中药成分-生物活性相关分析,能快速地从复杂中药体系中筛选活性成分。机体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)在体内累积,会损伤机体组织中蛋白质[3]、核酸和脂质等生物大分子[4],其中胰岛β细胞内抗氧化物水平较低,因此较其他组织更易受到氧化应激损伤[5]。ROS可直接损伤胰岛β细胞,特别是破坏线粒体结构,促进胰岛β细胞凋亡,导致胰岛β细胞减少[6]。对于糖尿病患者,在持续高血糖条件下,超氧产物会大幅度增加,当超氧产物的产生速率超过其移除速率,就会产生氧化应激,引起胰岛β细胞功能损伤及外周胰岛素抵抗,加重糖尿病病情[7]。因此,具有清除ROS作用的活性成分,有开发成为新型糖尿病药物的潜力。

本研究采集荜茇不同极性部位的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,考察不同极性部位的体外抗氧化活性,通过灰色关联分析探索荜茇的抗氧化活性谱效关系,探讨荜茇发挥抗氧化作用的物质基础,为荜茇的质量控制及后期深入开发利用提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030C 3D型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); Ultimate 3000 型超高效液相色谱仪(美国 Dionex 公司),串联 Thermo Q Exactive 型高分辨质谱(美国 Thermo Fisher Scientific 公司);Welch Ultimate C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 µm);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司);电子天平(上海浦春计量仪器有限公司);冷冻干燥器(东京理化器械株式会社);洁净安全柜(山东新华医疗器械股份有限公司);恒温水浴锅(上海一恒医疗器械有限公司);CO2恒温培养箱(美国Thermo Fisher科技公司);荧光倒置显微镜(德国Leica公司);FilterMax F5滤光片型多功能酶标仪(美国Molecular Devices科技公司);离心机(日本Hitachi公司);HIRAYAMA高压消毒锅(日本平山制作所株式会社)。

1.2 药材

荜茇药材购自内蒙古腾翔中药饮片公司,经内蒙古医科大学药学院生药教研室张慧文博士检定,符合《中国药典》2020年版规定。

1.3 试剂

RPMI1640培养基(以色列BI);灭活胎牛血清(以色列BI);青链霉素混合液(100×,美国Gibco);二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma);0.25 %胰蛋白酶(美国Gibco);β-巯基乙醇(美国Gibco);葡萄糖(美国Sigma);2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA,Solarbio);甲酸,甲醇,乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司);正丁醇(天津市福晨化学试剂厂);乙酸乙酯(天津市富宇精细化工有限公司);石油醚(天津市永晟精细化工有限公司)。

1.4 细胞

INS-1大鼠胰岛素瘤细胞株(上海中乔新舟生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 荜茇不同极性部位提取物的制备

取2 kg荜茇,粉碎,用70 %甲醇溶液30 L浸泡12 h,60 ℃下回流提取3次,每次1 h,过滤后合并滤液,浓缩后按1:1比例依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,减压浓缩后收集浸膏(I,91.7 g),得到石油醚部位(II,1.70 g)、乙酸乙酯部位(III,5.18 g)、正丁醇部位(IV,51.21 g)和水提部位(V,3.16 g)。分别以序号 I、II、III、IV、V依次表示荜茇70 %乙醇提取总部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位。

2.2 荜茇不同极性部位HPLC指纹图谱的建立

2.2.1 荜茇不同极性部位供试品溶液的制备 分别精密称取不同极性部位提取物约0.03 g,分别置20 ml量瓶中,加入甲醇,超声(功率300 W,频率50 kHz)20 min,放至室温,甲醇定容至刻度,摇匀后用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2.2 色谱条件 色谱柱:Welch Ultimate C18(250 mm×4.6 mm,5 µm)色谱柱;流动相:甲醇(A)-0.1 % 甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0~5 min,55 %A,5~25 min,55 %A~90 %A,25~50 min,90 %A~100 %A);流速:1 ml/min;检测波长为272 nm;柱温30 ℃;进样量20 μl。

2.2.3 质谱条件 离子源为HESI源;正离子检测模式,辅助气体体积流量30 L/min,喷雾电压4.00 kV,离子传输管温度300 ℃,辅助气温度100 ℃,碰撞能量(CE)为45 eV,检测方式为Full-MS/dd-MS2,Full MS分辨率70 000,dd-MS2分辨率17 500,扫描范围m/z100~1500。

2.2.4 HPLC指纹图谱特征峰的辨识 前期研究已建立荜茇HPLC指纹图谱[8],采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版),确定了18个共有峰。按2.2.1项下方法制备不同极性部位的供试品溶液,按2.2.2项下色谱条件进行HPLC图谱采集。色谱图见图1。

图1 荜茇不同极性提取物的HPLC图谱

查阅数据库及相关文献,采用Xcalibur 3.0软件进行峰提取、峰匹配等质谱数据处理,对荜茇进行化学成分分析,对比二级碎片离子、文献及胡椒碱标准品,鉴定18个指纹图谱特征峰,结果见表1。特征峰化学成分结构见图2。

表1 荜茇HPLC特征峰化学成分分析鉴定

图2 荜茇HPLC特征峰化学成分结构

2.3 荜茇不同极性部位的抗氧化活性

2.3.1 细胞培养 从液氮中取出冻存的INS-1胰岛β细胞,放入37 °C水浴锅中快速解冻,1000 r/min离心5 min,弃去上淸。加含10 %FBS的RPMI1640培养基吹打细胞,接种至含10 %胎牛血清的RPMI1640培养基中,5 % CO2,37 °C条件下培养24 h后换液。细胞长至亚融合状态,采用胰蛋白酶消化传代;每3 d按1:3比例传代1次,取对数生长期的细胞用于实验。

2.3.2 荜茇不同极性部位提取物对INS-1胰岛β细胞内ROS的影响 为探究荜茇不同极性部位提取物对高糖引起的INS-1胰岛β细胞氧化应激损伤是否具有改善作用,采用16.7 mmol/L葡萄糖直接损伤胰岛β细胞,建立高糖细胞模型,以荜茇不同极性部位提取物处理细胞。对每组细胞内的ROS进行荧光探针标记,以乙酰半胱氨酸为阳性对照。用含10 % FBS的正常完全RPMI 1640培养液将INS-1胰岛β细胞接种于96孔黑板,细胞密度为1×105个/ml,置37 ℃,5 % CO2培养箱中培养24 h。小心弃去培养液,PBS小心漂洗一次后,按照分组处理24 h,吸去孔中原培养液,用无血清培养基洗两遍,洗去孔中剩余的血清。每孔加入10 µmol/L DCFH-DA(无血清培养基配制)50 µl,培养30 min。吸去DCFH-DA,用PBS洗两遍,避免探针对结果的影响。吸掉孔中原培养液,每孔加入PBS 100 µl,于激发波长485 nm/发射波长535 nm测荧光,结果见表2。

表2 荜茇不同极性部位提取物对INS-1胰岛β细胞内ROS的影响(±s,n=6)

表2 荜茇不同极性部位提取物对INS-1胰岛β细胞内ROS的影响(±s,n=6)

注:**P<0.01,*P<0.05 vs 正常细胞;ΔΔP<0.01,ΔP<0.05 vs模型细胞

分组ROS值正常组 4965.00±397.62高糖模型组 6878.33±1000.90**1000 μg/ml I处理组 5709.00±278.14*Δ 500 μg/ml II处理组 6902.50±65.76**Δ 1000 μg/ml III处理组 6887.25±532.06**1000 μg/ml IV处理组 5676.33±432.76ΔΔ 1000 μg/ml V处理组6326.33±93.85**阳性对照组6640.625±115.08**

2.4 荜茇不同极性部位HPLC图谱与抗氧化活性的灰色关联度分析

灰色关联度分析模型[9]通过比较序列几何曲线之间距离的相近性来判断其相似性,序列间距离越短,则关联度越大,序列越相似。进行灰色绝对关联度计算时,需对原始数据进行无量纲化处理,然后根据公式计算灰色关联度。本研究借助“灰色关联度分析软件”第七版,可直接得出灰色关联度,简化了实验数据的处理过程[10]。本研究以荜茇不同部位的体外抗氧化活性为系统特征行为序列,以荜茇各极性部位HPLC特征峰平均峰面积为相关因素行为序列,计算二者之间的灰色关联度,可直接反应相关因素行为序列对系统特征行为序列的影响程度,结果见表3。

表3 荜茇不同极性部位指纹图谱特征峰面积与体外抗氧化活性的灰色关联度

采用灰色关联度分析方法,对荜茇各极性部位HPLC特征峰平均峰面积与荜茇不同部位体外抗氧化活性进行谱效相关性分析,结合灰色关联度系数与排序,考察荜茇18个特征峰与抗氧化活性的相关性。结果显示灰色关联度较高的10个化合物分别是1(荜茇宁,piperlonguminine),7(pipernonaline),5(pipercallosine),6(dehydropipernonaline),4(墙草碱,pellitorin),3(胡椒碱,p i p e r i n e),8(假荜茇酰胺B,retrofractamide B),12(brachystamide B),11[(2E,4E,13E)-14-(benzo[d][1,3]dioxol-6-yl)-Nisobutyltetradeca-2,4,13-trienamide]和10(几内亚胡椒碱,guineensine)号峰,说明这10个化合物对抗氧化活性贡献较大。

3 讨论

与1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)和2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)抗氧化活性实验比较,基于细胞模型的体外抗氧化活性实验更能反映药物抗氧化活性的真实水平。因此,本文对每组细胞内的ROS进行荧光探针标记,从而测定不同药物处理组细胞内ROS水平,其结果能更为准确地反映荜茇不同极性部位提取物的抗氧化活性,及对高糖引起的INS-1胰岛β细胞氧化应激损伤是否具有改善作用。

荜茇是药食同源传统习用药材,其毒性低,具有较好的抗氧化活性,并对胰岛细胞氧化应激具有保护作用,可开发为天然抗氧化剂,用于药品、食品等领域,具有良好的开发和研究价值。

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