芬顿反应在化学动力学治疗中的应用

陈 艳，郑芷叶，欧阳溢凡，魏鼎泰，艾克拜尔·热合曼*

（1.宁德师范学院 医学院，福建 宁德 352100；2.福州大学 化学学院，福建 福州 350108；3.宁德师范学院附属宁德市医院 放射科，福建 宁德 352100；4.福建省毒物与药物毒理学重点实验室，福建 宁德 352100）

癌症是全球主要的公共卫生问题，人们投入了大量的物力和财力来开发新的肿瘤治疗方法，但癌症的复杂性、多样性和异质性导致临床效果有限.因此，为了提高患者的治疗效果，需要更多的癌症治疗方式来补充现有的治疗方法.癌细胞是从人体正常细胞发展而来，用常规的化疗药物对其进行选择性治疗是很困难的.据报道，肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）具有偏酸性、过氧化氢酶活性过高、谷胱甘肽浓度过高和缺氧等特性[1]11.TME这种特殊性不仅为肿瘤转移提供了良好的环境，而且对高效选择性治疗癌症提供了可能性.在过去的几十年间，人们构建了大量基于TME 的响应型纳米药物递送体系，但低负载效率和高泄漏风险在一定程度上限制了临床治疗效果.2016 年，Bu 和Zhang 课题组[2]首次提出化学动力学疗法（chemodynamic therapy，CDT），与传统的肿瘤治疗方法不同，CDT 是利用肿瘤特殊的微环境，如弱酸性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和H2O2过表达等，以过渡金属纳米材料为催化剂，发生芬顿或类芬顿反应产生羟基自由基，用于肿瘤特异性治疗.

在传统的芬顿反应中，Fe2+与H2O2可生成高活性的羟基自由基(Fe2++H2O2→Fe3++•OH).羟基自由基相比于其他种类的活性氧自由基[E(1O2/H2O)=2.17 V，E(H2O2/H2O)=1.78 V]，具有最高的氧化还原电势E(•OH/H2O)=2.8 V[3-4].除了铁，其他一些金属（如Cu、Mn、Co 等）也可以作为芬顿反应试剂，发生类芬顿反应产生羟基自由基[1]11.芬顿及类芬顿反应的效率低是限制CDT 在活体治疗应用的最大阻碍.在复杂的活体实验中，导致芬顿反应效率低的原因有：1）H2O2的量不足.尽管肿瘤部位的H2O2含量高于正常组织，但H2O2的量仍不足以产生足够多的羟基自由基杀死癌细胞.2）肿瘤微环境的弱酸性.肿瘤微环境的pH 可能不是芬顿及类芬顿反应的最佳反应pH 值.3）还原性物质含量过高（如GSH、H2S 等）.还原性物质会中和羟基自由基，降低治疗效果.4）反应催化剂效率低.金属的催化活性、靶向位点游离金属的含量，及高催化活性金属离子的循环利用率都会制约CDT的效果[5-6].针对这些问题，可以通过优化芬顿及类芬顿反应催化剂体系、调节肿瘤微环境、增强催化剂效率和协同治疗的方法提高CDT的治疗效率.

1.芬顿及类芬顿反应催化剂

1.1 铁基芬顿反应催化剂

目前，研究最广泛的芬顿反应催化剂仍然是铁基材料.Fe3O4纳米粒子具有很好的生物活性和pH 响应性，是芬顿反应中最常用的铁基催化剂.然而，传统的Fe3O4纳米催化剂在酸性肿瘤微环境中的响应性能较低，会制约•OH 的产生效率.针对这一问题，Zhang 等[7]开发了一种非晶态铁纳米颗粒（AFeNPs），与传统的Fe3O4纳米颗粒相比，AFeNPs 对肿瘤酸性环境的反应更加灵敏和快速.在pH=5.4 和pH=6.5 条件下，6 h内亚铁离子的释放量分别达到100%和57%，而在中性pH条件下几乎没有释放.由于亚铁离子的快速酸响应释放，AFeNPs表现出良好的•OH生成能力.

除了无机材料外，金属有机骨架材料由于其多孔结构和优异的催化性能，被广泛应用于CDT[8-9].Zheng 等[10]利用p53（一种肿瘤抑制蛋白和转录因子）的氧化应激调节能力和MOFs 的芬顿反应诱导能力，将铁-聚苯酚聚合物（mental-organic network,MON）包裹在p53质粒表面（MON-p53），通过铁死亡/凋亡混合途径彻底清除癌细胞.p53 蛋白具有诱导细胞凋亡的功能，可抑制细胞内活性氧自由基的消除；铁-聚苯酚聚合物在癌细胞内会诱导发生芬顿反应产生活性氧自由基，二者协同作用导致生物膜的脂质过氧化而引发氧化应激触发铁死亡.长期活体实验证明，MON-p53治疗不仅可以抑制肿瘤的生长，还可以延长荷瘤小鼠的寿命.MON-p53 用于癌症肿瘤治疗的原理如图1 所示.图1 中，I 表示MON-p53 被细胞内吞；II 为MON 引发芬顿反应（Fenton Reaction）；III 表示p53 蛋白的转染和表达；IV 指跨膜蛋白被抑制；V 为芬顿反应导致脂质过氧化物（lipid peroxidation，LPO）含量升高，同时跨膜蛋白抑制导致GSH含量降低，最终导致细胞铁死亡.

1.2 铜基类芬顿反应催化剂

传统的铁基芬顿反应通常发生在较窄且较低的pH范围内（pH=2.5～4.5），而肿瘤微环境一般为弱酸性条件（pH=6.0～6.7），肿瘤的酸性条件无法满足高效芬顿反应的要求，因而治疗效果有限.据报道，基于铜基催化剂的类芬顿反应可以在弱酸性和中性介质中高效发生，其最高反应速率（1×104mol·L-1·s-1）比Fe2+提高了约160倍[11-12].Hu等[13]制备了一种超小聚乙二醇修饰的Cu2-xS纳米点，可在较宽的pH范围内实现H2O2向•OH 的转化.Cu2-xS 纳米点相比于其他铁基催化剂表现出了更好的催化性能.Chen 等[14]合成了一种牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）修饰的黄铜矿纳米颗粒（BSA-CuFeS2NPs），其发生的类芬顿反应不依赖于pH值，可在肿瘤微环境中高效生成羟基自由基.

除此之外，利用耐药癌细胞中高水平、相对脆弱，但动态平衡的细胞氧化还原稳态，Liu 等[15]设计合成了一种纳米铜-儿茶酚金属有机框架材料（copper/catechol-based metal-organic framework,CuHPT），能够有效打乱这种平衡，使平衡向氧化应激倾斜，最终杀死癌细胞.在耐药癌细胞中GSH 的作用下，CuHPT会发生分解，同时释放出儿茶酚配体和还原性亚铜离子（Cu+）.经过二者的协同作用，通过自氧化和类芬顿反应来放大耐药癌细胞内活性氧自由基的产生.活体实验证明，CuHPT 可有效抑制体内耐药性肿瘤的生长，并使荷瘤小鼠的存活时间加倍.CuHPT用于耐药性肿瘤细胞治疗的原理如图2所示.图2中，a 为不同类型细胞的氧化还原稳态；b 为破坏细胞氧化还原稳态的策略；c 为CuHPT 的制备及其对耐药癌细胞的抗肿瘤机制.c 图中，①为CuHPT 将细胞GSH 氧化为GSSG，同时释放HPT 和Cu+;②为HPT产生H2O2提高细胞ROS水平;③为Cu+将H2O2分解为产生致命的•OH.

图2 CuHPT用于耐药性肿瘤细胞的治疗的原理[15]

在人体中，铜是许多天然酶氧化还原反应的辅助因子.通常来说，大多数生物活性铜都连接在蛋白质和其他配体上，过量的游离铜可能引起严重的全身毒性[16-17].因此，要实现铜基类芬顿反应的CDT 应用，重要的是将铜离子限制在肿瘤细胞内，避免在体内循环中出现游离铜离子[18-19].

1.3 其他金属类芬顿反应催化剂

在类芬顿反应中，锰基、钴基、银基和过渡金属基纳米催化剂也被用于CDT[20-23].Wang 等[24]报道了一种基于Mn2+的多功能纳米平台H-MnCO3/Ce6-PEG（HMCP NCs），通过CDT 和光动力学治疗（photodynamic therapy,PDT）的协同作用，实现癌症肿瘤的治疗.在肿瘤微酸条件下，MnCO3分解释放出Mn2+，通过类芬顿反应催化内源性H2O2生成•OH.同时，光敏剂Ce6在光照射下产生高浓度的1O2.最终，CDT 和PDT的协同作用导致细胞内氧化压力增加，杀死癌细胞.锰基催化剂HMCP NCs的制备过程和CDT、PDT的协同治疗原理如图3所示.图3中，I表示在外部激光照射下，Ce6可以通过多步光化学过程产生单线态氧(1O2)，应用于PDT；II 表明，MnCO3可以在酸性TME 中特异性降解为Mn2+，触发类芬顿反应，将内源性H2O2转化为羟基自由基(•OH).可见，虽然这些类芬顿反应催化剂在体内和体外治疗中都显示出很好的效果，但仍存在一些挑战，如毒性和生物安全性等.

图3 锰基催化剂HMCP NCs的制备过程（a）和CDT、PDT协同治疗的原理（b）[24]

2 增强CDT的治疗效果

CDT 已被广泛应用于肿瘤治疗，但由于芬顿反应条件恶劣、反应效率有限、生理环境复杂等因素，其在体内的进一步应用仍受到限制[25].目前已报道了多种改进策略以提高芬顿反应在CDT 中的治疗效率.

2.1 调节肿瘤微环境

由于芬顿反应发生在肿瘤部位，肿瘤微环境直接影响羟基自由基的生成效率，因此可以通过调节肿瘤微环境来提高CDT疗效.

传统铁基芬顿反应的反应速率与环境中H+的浓度密切相关，在较低的pH（pH=2.5～4.5）条件下，铁基芬顿反应更有效[26].然而，肿瘤微环境pH值在6.5左右，不利于铁基芬顿反应的高效发生[27].据报道，葡萄糖氧化酶GOx可以消耗葡萄糖和氧气生成葡萄糖酸和H2O2，利用这个反应可以同时提高肿瘤微环境中的H2O2水平和酸度[28].此外，Chen等[29]报道了一种纳米复合材料会对癌细胞产生剧烈的氧化损伤同时抑制肿瘤转移.在非晶态铁纳米粒子（AFeNPs）中负载碳酸酐酶IX（carbon anhydrase IX,CAI）抑制剂，构建了纳米复合材料（AFeNPs@CAI）.抑制肿瘤细胞中的CAI 会增加H+浓度，进而通过芬顿反应加速•OH的生成，从而诱导肿瘤细胞死亡.同时，细胞外H+的生成减少会阻碍肿瘤细胞外基质的降解，进而抑制肿瘤的转移.同样，Shi 等[30]设计了一种纳米催化剂（FePt@FeOx@TAM-PEG），通过控制调节肿瘤部位的酸性来增强CDT的效率.借助他莫西芬（tamoxifen,TAM）药物的pH 响应特性，FePt@FeOx 的催化活性在酸性微环境中“开启”.药物TAM 一旦进入癌细胞，会抑制线粒体复合体，导致肿瘤中H+的积累，进而提高芬顿反应的催化效率，具体如图4所示.

图4 酸响应纳米催化剂(FePt@FeOx@TAM-PEG)提高芬顿反应催化效率的示意图[30]

由图4 可见，药物TAM 的pH 值响应性使FePt@FeOx 的催化活性在酸性肿瘤环境中激活，在中性条件下被抑制.释放的TAM 能够抑制线粒体复合体活性，导致乳酸含量升高，从而使细胞内H+积累，进而克服肿瘤本身酸度不足的问题.通过正反馈回路，大量的活性FePt@FeOx 纳米催化剂被释放出来，接触到内源性H2O2，在酸性条件下发生类芬顿反应产生羟基自由基（·OH）.

肿瘤组织中H2O2含量不足也是限制芬顿反应效率的一个重要因素[31].因此,，可以通过增加肿瘤部位H2O2含量来提高芬顿反应效率[32].虽然，在纳米材料中直接负载H2O2是提高CDT 效率的有效方法，但在递送过程中，H2O2的泄漏可能会造成严重的组织损伤[33-34].因此，解决这个问题的合理选择是开发一种方法，即通过肿瘤的特异性触发H2O2的生成.Fan 等[35]在过表达呼吸链酶II（NDH-2）重组大肠杆菌（E.coli）MG1655 表面连接Fe3O4纳米颗粒，形成一体化生物反应器（Ec-pE@MNP）.在大肠杆菌MG1655 呼吸过程中，NDH-2可以将NADH中的电子转移到O2中，产生H2O2.此外，Ec-pE@MNP 定植在肿瘤中可以保证Fe3O4纳米颗粒在肿瘤中有充足的积累.因此，Ec-pE@MNP 可以释放大量•OH 杀死肿瘤细胞，而无需在肿瘤区域引入额外的H2O2.外源性金属基芬顿纳米催化剂不可避免地对人体造成慢性和急性损伤.2020 年8 月，Lin 等[36]使用ROOH 作为芬顿反应的高效剂，利用细胞内活性铁池（labile iron pool，LIP）作为内生催化剂产生自由基.在Fe2+存在条件下，R'OOH表现出与H2O2相当的自由基生成能力.此外，与H2O2相比，GSH/谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）更难清除R'OOH.在这个研究中，一种pH 响应聚合物被用于同时递送亚油酸甲酯过氧化氢（methyl linoleate hydroperoxide，MLH，一种R'OOH模型分子）和爱拉斯汀（erastin，Era，一种铁死亡诱导剂），为实现高效CDT 和缓解外源性金属基纳米催化剂造成的不利影响提供了一种新策略.内源性铁池介导的芬顿反应在癌症化学动力学治疗中的具体应用情况如图5 所示.图5（a）中，R'OOH 在Fe2+存在条件下发生芬顿反应生成自由基，同时在硫醇生物大分子或酶作用下被还原.相比于H2O2、R'OOR'和内过氧化物，R'OOH 的CDT效率最高.图5（b）为携带MLH和Era的纳米治疗试剂增强CDT效率的示意图.

图5 内源性铁池介导的芬顿反应在癌症化学动力学治疗中的应用[36]

GSH 表达水平高是肿瘤微环境的另一个特征，GSH 表达水平通常与肿瘤部位高氧化环境相平衡.CDT会产生大量的•OH来打破这种平衡，但同时高水平的GSH会抑制•OH的氧化[37].Ma等[19]利用铜离子和半胱氨酸（cysteine，Cys）自组装形成的纳米平台（Cu-Cys NPs），实现了增强的CDT并用于治疗耐药乳腺癌.Cu-Cys NPs 合成工艺示意图和含铜纳米制剂介导CDT 疗法的原理如图6 所示.由图6 可见，Cu-Cys NPs被肿瘤细胞内吞后，首先将过表达的GSH氧化为GSSH，同时将Cu2+还原为具有较高的催化活性Cu+；随后，Cu+催化H2O2通过类芬顿反应产生具有强氧化性的•OH，导致肿瘤细胞死亡.此外，由于肿瘤部位GSH和H2O2含量较高，Cu-Cys NPs可在肿瘤细胞中引发闭环氧化还原反应.

图6 Cu-Cys NPs合成工艺示意图和含铜纳米制剂介导CDT疗法的原理[19]

2.2 增强催化效率

金属基纳米催化剂催化效率低也是影响CDT 效率的重要因素.由于金属离子在催化过程中容易通过氧化还原过程改变价态，不同价态的金属离子催化效率不同.通常情况下，较稳定价态的催化活性低于亚稳价态.因此，将金属离子保持在亚稳态（Fe2+、Cu+等）有利于提高芬顿反应的催化效率，达到更好的CDT 治疗效果.Zhang 等[38]通过将葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）封装在沸石型骨架（ZIF-8）中，然后被单宁酸（tannic acid，TA）和Fe3+构成的金属多酚网络（etal polyphenol network，MPN）包裹，设计合成了ATP 响应的芬顿纳米平台（GOx@ZIF@MPN）（图7）.图7 中，A 是GOx@ZIF@MPN 的制备过程；B 为GOx@ZIF@MPN 进入肿瘤细胞后，消耗葡萄糖、自供H2O2和加速Fe(III)/Fe(II)转化的详细过程.从图7 可见，在ATP 过表达的肿瘤组织中，GOx@ZIF@MPN 降解释放Fe3+、TA 和内部的GOx.GOx可与葡萄糖原位生成H2O2，同时TA 可将催化效率低的Fe3+转化为催化效率高的Fe2+，通过持续生成H2O2和Fe2+，放大芬顿反应效率.体内实验结果表明，自催化芬顿纳米系统具有良好的抗肿瘤效果，为实现高效CDT 治疗肿瘤提供了新的策略.另外一种增强催化效率的改进策略是增加催化剂含量.2023年，Liu等[39]合成了一种含铁的类蛋白超分子铁递送系统用于铁死亡肿瘤治疗，这种超分子中铁的质量分数高达42%，远远高于铁蛋白.在GSH过表达的肿瘤微环境中，这种超分子会分解，同时消耗GSH并释放Fe2+，实现增强的CDT治疗效果.

图7 自催化芬顿纳米体系GOx@ZIF@MPN用于肿瘤治疗的原理[38]

2.3 协同治疗

CDT在癌症治疗中还可以结合其他治疗方式来提高整体治疗效果，其他治疗方式包括化疗（chemotherapty，CT）、光热治疗（photothermal therapy，PTT）、PDT、饥饿治疗（starvation therapy，ST）和免疫治疗等[40-43].研究表明，局部提高肿瘤组织的温度可加速芬顿反应生成•OH的能力[44]，通过光热效应增加的局部温度可以同时实现PTT 和增强的CDT.Wang 等[45]构建了反铁磁性黄铁矿聚乙二醇（FeS2-PEG）纳米立方体，利用肿瘤中过量的过氧化物实现CDT.在近红外光照射下，FeS2-PEG 会局部产生热量，这不仅实现了PTT，而且增强了CDT 的治疗效果.在酸性条件下，FeS2-PEG 催化分解H2O2产生有毒的•OH.当温度升高到318 K时，可以检测到更强的•OH信号，这表明温度升高确实提高了•OH的生成效率.

3 结论与展望

在传统的癌症治疗中，化疗是临床最常用的方法.然而，副作用大和耐药性的产生最终可能会导致治疗失败.近10年来，基于CDT的癌症治疗研究受到越来越多的关注.本文总结了芬顿及类芬顿反应催化剂体系及各种提高CDT 效率的策略，包括调节肿瘤微环境、增强催化剂效率及协同治疗等.尽管CDT在动物实验中的基础研究显示出良好的肿瘤生长抑制作用，但对CDT的相关研究仍处于早期阶段.CDT试剂的开发需要充分考虑特异性、选择性、效率、可降解性、响应性、递送性、靶向性和生物安全性等.下一代CDT 试剂研究除了考虑治疗效果以外，还应当侧重安全性、对人体的毒理和病理学研究，这将大大提高CDT 的临床转化潜力.CDT 纳米制剂的不断创新和发展，以及对后续测试条件的优化和改进，将为未来癌症的全面治疗提供新的方向和希望.