组织工程皮肤血管化策略及研究进展

刘剑 汪振星 孙家明

【提要】 组织工程皮肤作为皮肤缺损治疗的替代解决方案，其核心思想是利用支架、种子细胞或者生物活性分子来促进皮肤的修复重建。在过去几十年里，该领域发展迅速，各种改善皮肤再生的策略层出不穷。然而，尽管有诸多组织工程皮肤产品已经被商业化生产并应用于临床，但仍存在诸多问题需要进一步研究解决。其中，组织工程皮肤的血管化是关键挑战之一。目前，已有大量基础研究致力于解决组织工程皮肤的血管化难题，可以分为两大类，即基于各种生长因子、种子细胞或活性纳米颗粒的促血管生成策略，以及基于组织工程皮肤支架的体内、外预血管化策略。本文将从上述两个方面分别概述其促进组织工程皮肤血管化的优缺点，并介绍最新进展。

因创伤、体表肿瘤切除、慢性创面等原因造成的皮肤缺损是临床常见问题。在我国，每年因不同原因造成的皮肤缺损患者高达数千万[1]。目前，临床上针对皮肤缺损的治疗主要为皮肤移植，包括自体皮肤移植、同种异体皮肤移植、异种皮肤移植三大类，以自体皮肤移植最为常见。然而，上述治疗方法虽然能够有效解决皮肤缺损的问题，但是也有诸多缺点，如造成供区损伤、供区皮肤来源不足、移植物免疫排斥等[2-3]。近年来，随着组织工程和再生医学领域的发展，使得皮肤缺损的替代治疗成为可能。

组织工程皮肤是指通过组织工程技术，利用细胞或细胞外基质构建的，具有一定生理功能的人工皮肤，可用于修复创面和重建皮肤功能[4]。目前，已有多种人工皮肤产品制备成功，并投入临床使用。包括表皮替代物、真皮替代物、复合皮肤替代物三大类。代表性产品有Integra、Dermagraft、Apligraf、安体肤等[5]。然而，上述产品对于皮肤缺损的治疗，大部分只具备覆盖创面和促进创面愈合的作用，并不能完整实现皮肤的结构和功能的重建。完整的皮肤结构由表皮层、真皮层和皮下组织三层构成，具有保护、感觉、分泌、代谢等重要作用[6]。其中，表皮层主要由角质形成细胞组成，内部没有血管网络结构，主要依靠真皮层中的血管提供营养支持。真皮层主要由成纤维细胞组成，其合成的细胞外基质能够有效维持皮肤的机械强度和弹性。此外，该层还包含大量的血管网络结构和皮肤附属器，能够有效发挥营养物质运输和废物排泄的作用。皮下组织主要是血管化的脂肪组织，对于保持体温和脂肪储存具有重要作用。因此，理想的组织工程皮肤除了能够恢复皮肤的屏障功能外，还应该重建正常皮肤所包含的内部血管结构和附属器（毛发、汗腺、皮脂腺等），以更大程度实现皮肤的功能重建。其中，血管化难题是制约组织工程皮肤发展的关键问题之一。

目前，由于组织工程皮肤内部不具有血管结构，早期营养供应主要依赖创面底部营养渗透作用，因此对于移植皮肤厚度要求较高（一般不超过1.0 mm）[7]。此外，尽管患者自身的血管能够长入组织工程皮肤内部，但是该过程速度较慢（约5 μm/h）[8-9]，无法满足大部分细胞的早期营养供应。因此，对于较大、较深范围的皮肤缺损，则应用受限。为了解决上述问题，促进组织工程皮肤早期血管化的策略已被广泛研究。总的来说，这些策略可以分为两大类，即血管生成和预血管化[10]。其中，血管生成包括在支架植入后刺激支架内血管形成的所有策略，如基于添加各种生长因子和/或接种不同细胞成分从而促进的血管形成。预血管化是指在将组织工程皮肤应用于创面修复之前，即将支架提前血管化的技术[11]。该技术的主要优点在于能够将血管化的组织工程皮肤早期快速整合至受体的血管网络中，可有效避免营养供应不足或不均的现象发生。本文将从以上两个方面分别阐述组织工程皮肤的血管化策略，并介绍最新研究进展。

1 血管生成策略

1.1 基于生长因子的血管生成策略

生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。生长因子在创面愈合的各阶段均发挥着重要作用，如血管内皮细胞因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板源性生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、血管生成素等多种生长因子[12-15]。虽然这些生长因子能够有效促进血管生成，但在生理条件下浓度均较低，无法满足良好血管化的需求，即无法避免组织缺氧和细胞坏死[16]。因此，通过在组织工程皮肤中直接补充各种生长因子以促进血管形成是一种最直接的办法。其中，VEGF 自从于1989 年由Leung 等[17-19]首次分离、纯化以来，即在组织工程领域尤其在促进创面愈合方面成为研究最为广泛的生长因子。然而，各种生长因子在体内降解周期较短，无法保持长期稳定存在，因此将其直接应用于体内的促血管生成效应并不确切，而且当使用剂量过大时甚至还可能造成其他不良后果，如肿瘤形成[20-21]。

为了使生长因子能够在组织工程皮肤中持续、稳定地发挥作用，大量针对药物释放系统的研究逐渐成为重点探索方向。常见的药物释放系统包括水凝胶、聚合物微纳米结构和智能响应系统等。Hosseikhani 等[22]发现，将bFGF 包裹至可注射水凝胶中，可有效延长bFGF 的作用周期，并促进小鼠皮肤血管化。Jiang 等[23]利用聚己内酯（PCL）纳米纤维和装载VEGF 的明胶颗粒作为药物释放系统，该体系在2.5 d 内，可快速释放50%的VEGF；在后续的7.5 d 里，可持续释放负载总量80%的VEGF，并最终达到促进血管新生、成熟的效果。此外，基于静电纺丝技术制备的核壳结构、“三明治”结构、层层堆叠结构也是常用的药物释放体系[24-25]。以核壳结构为例，外部的壳层结构可充当物理屏障，以减缓核层结构中生长因子的释放，而且还可通过调节内外层次的组成成分和结构特点，来控制生长因子的释放速率[26]。Tabata等[27-28]比较了不同组成成分核壳纳米纤维释放bFGF 的情况，两种核壳纳米纤维的外层均基于聚乙二醇（PEG）构成，内层则分别由壳聚糖水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）构成，结果表明前者生长因子释放较缓慢，而后者速率较快，说明通过核壳结构能够有效控制生长因子的释放。上述水凝胶、纳米纤维或者其他聚合物微纳米结构释放生长因子的方式，通常依赖于负载材料的降解，这些体系的构建方式不仅简单，而且一般能够取得较好的控释效果。此外，一些载药体系能够根据局部微环境的变化或外部刺激来控制药物的释放，这些药物释放系统被认为是“智能响应系统”。根据所响应刺激的不同，可分为：①温度响应型[29]；②pH 响应型[29]；③光响应型[30]；④超声响应型[31]；⑤机械压力响应型[32]；⑥离子响应型[33]；⑦酶响应型等[34]。为了促进新生血管化，Lee 等[32]率先开发了一种机械刺激响应型释放系统，其制备的海藻酸盐水凝胶，可在机械刺激下稳定释放VEGF-A。体内实验结果表明，受到机械刺激的糖尿病小鼠新生血管数量明显增加。Moncion 等[35]制备了超声刺激响应型的纤维蛋白支架，可在超声刺激下按需释放bFGF，可达到促进新生血管化的效果。

1.2 基于细胞的血管生成策略

除了直接应用生长因子之外，通过将细胞接种至组织工程皮肤上，也是促进新生血管形成的重要方法。比较常用的细胞包括多种干细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。

干细胞在新生血管形成过程中发挥着重要作用，除了可以通过分泌多种生长因子（包括VEGF-A、FGF、TGF-β 等）来诱导血管内皮细胞的迁移和增殖之外，还可以自身分化为血管内皮细胞直接参与新生血管的形成[36]。根据其来源的不 同，如 内 皮 祖 细 胞（Endothelial progenitor cell，EPC）、骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived stem cell，BMSC）、脂肪间充质干细胞（Adiposederived stem cell，ADSC）、胚胎干细胞（Embryonic stem cell，PSC）、 诱 导 多 能 干 细 胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）等，均在组织工程皮肤中有所应用。EPC 因同时具备内皮细胞和祖细胞的特征，在促进组织工程皮肤血管化方面应用广泛[37]。Zhang 等[38]将EPC 接种于商品化的Integra基质上，2 周后观察发现，与未接种细胞的支架相比，皮肤血管化程度显著增加。Wang 等[39]研究了聚己内酯-胶原生物活性支架在接种骨髓来源的EPC 之后，能够通过激活HIF-α、SDF-1α 通路来促进新生血管的形成，并改善伤口的愈合。

除EPC 之外，BMSC、ADSC 也被广泛用于促血管化相关研究。Chen 等[40]将BMSC 诱导分化后，通过分析其内皮特异性标志物的表达和功能，证实了BMSC 具有较好的促新生血管化作用。Lin等[41]进一步证明了将BMSC 接种至合成支架上能够有效诱导新生血管化，促进皮瓣的再生。虽然BMSC 可有效促进组织血管化，但是获取骨髓的方式为侵入性操作，使其在临床使用上受限。相较于BMSC，ADSC 的获取更为方便，对于供体的损伤也较轻，而且获得的干细胞数量是骨髓来源方式的500 倍[42]。Eke 等[43]将ADSC 整合至明胶/透明质酸水凝胶中，体内试验结果表明，与无细胞水凝胶相比，含有ADSC 的水凝胶诱导形成的新生血管数量增加了3 倍，证实了ADSC 促血管生成效应。Hu 等[44-45]直接将ADSC 接种至全层异体皮肤上用于小鼠慢性创面的修复，结果表明接种ADSC 的实验组能够显著提高移植物存活率并促进血管化。

iPSC 在促进组织工程皮肤血管化方面也具有巨大的潜力。Lin 等[46]通过诱导iPSC 衍生的间充质干细胞，获得了具有血管生长潜能的表皮样细胞系，为构建良好血管化的组织工程皮肤提供了新的选择。Tan 等[47]将iPSC 衍生的血管内皮细胞接种至聚己内酯-明胶纳米纤维支架上，体外结果表明，负载有iPSC 衍生的血管内皮细胞的支架在培养7 d 后，促血管生成生长因子相关基因表达上调。植入大鼠皮下后，多普勒灌注监测显示，经由接种细胞的支架处理后的大鼠血液灌注明显增高。免疫组化检测结果也表明接种细胞组的毛细血管密度明显升高。然而，iPSC 的使用受到诸多安全问题的限制，如肿瘤形成相关风险。因此，在广泛临床应用之前，该方法尚需进一步深入研究[48]。

除了干细胞之外，一些体细胞也具有促进血管化的潜力，其中最常使用的便是血管内皮细胞。血管内皮细胞是构成血管的基本组分之一，目前使用细胞来促进血管化的策略中，大部分都直接或间接地使用了血管内皮细胞。Abaci 等[49]通过将人来源的血管内皮细胞混合至胶原中培养，显著增加了组织工程皮肤的血管化程度，有效避免中心区域组织的坏死，并促进了毛发的再生。成纤维细胞作为参与伤口愈合的主要细胞，也具有辅助新生血管形成的作用。其分泌的纤维蛋白和细胞外基质分子能够促进其他细胞在三维支架内部的黏附和增殖，对于血管内皮细胞的存活及其组成新生血管具有极其重要的作用[50]。

1.3 基于活性纳米颗粒的血管生成策略

除了上述两类比较常见的血管生成策略之外，一些基于活性纳米颗粒的血管生成策略也被陆续研究。这些活性纳米颗粒可以通过诱导活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的生成，或者通过负载一些活性分子，如质粒DNA、MicroRNA、GF等，来达到促进新生血管形成的效果[51-52]。

一些金属或者非金属的纳米颗粒已经陆续被证明可通过诱导ROS 的生成来达到促进血管生成的效果。ROS，是生物有氧代谢过程中的一种副产物，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等，因其存在未配对的自由电子，而具有很强的化学反应活性。在高浓度水平下，具有很强的细胞毒性，可引起氧化应激反应、内皮细胞功能障碍和慢性炎症等[51]。然而，在低浓度水平下，却能刺激细胞的增殖、迁移和分化，甚至还可以通过p38MAPK/Akt、HIF-1α 信号通路来调节血管生成相关基因的表达及生长因子的分泌[53]。其中，关于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）/还原氧化石墨烯（Reduced graphene oxide，rGO）[54]、氧化锌（ZnO）/过氧化锌（ZnO2）[55]、碳纳米管（Carbon nanotubes，CNT）[56]等纳米材料的研究尤为广泛。Mukherjee 等[54]证明了GO 和rGO 在浓度低于50 ng/mL 时具有促血管生成效应；体外迁移试验证明，相较于VEGF（40 ng/mL），GO 和rGO 在促进血管内皮细胞迁移方面具有更好的效果。但在高浓度GO/rGO 水平下，则会抑制新血管的形成，甚至破坏原有的血管结构。这可能与过高浓度ROS 造成的氧化应激反应有关。Li 等[57]证实，混合有低浓度GO 的胶原蛋白支架能够促进创面的愈合，并提高新生血管化程度。ZnO/ZnO2在促进创面愈合上也具有良好作用。Augustine 等[58-59]利用聚己内酯纳米纤维负载低浓度的ZnO，用于豚鼠全层皮肤缺损修复的研究。结果表明，质量分数为1%的ZnO 支架能够促进大量血管生成，全层皮肤缺损创面可于5 d 内完全修复。需要指出的是，利用上述纳米颗粒来促进血管生成的效应是浓度依赖性的。因此，严格控制诱导ROS 生成的纳米颗粒浓度非常关键，否则可能会造成不利后果。

除了上述通过诱导ROS 的生成来促进新生血管形成的纳米颗粒之外，还有一些纳米颗粒可通过直接负载活性分子的途径来达到促进新生血管化的效果。Devalliere 等[60]利用PLGA 纳米颗粒来负载microRNA-132 活性分子，并将其进一步转染人静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell，hUVEC），在体外试验中达到了促进hUVEC 迁移、增殖的效果，且体内试验发现微血管化程度提高近2 倍，证明该纳米颗粒负载的microRNA-132 活性分子能够抑制p120RasGAP的表达，进而激活Ras 系统，从而促进新生血管形成[61]。Dong 等[62]将可编码VEGF 的mRNA 负载到可电离脂质纳米颗粒中，该脂质纳米颗粒通过表达VEGF 蛋白达到显著提高新生血管化的效果。He 等[52]则将编码VEGF 的质粒DNA 负载到PLGA/聚乙醇胺纳米颗粒上，并取得同样的效果。此外，Lai 等[63]的研究证明，明胶纳米颗粒负载PDGF 活性分子，在体外试验中可促进hUVEC 的生长，并形成管腔样结构；将其应用于糖尿病大鼠创面修复，可促进创面的愈合。

2 预血管化策略

上述各种血管生成策略从不同角度提出了促进组织工程皮肤血管化的新方法，但均受限于新生血管较慢的生长速度。因此，对于大尺寸的皮肤缺损修复，使用含有预先建立有血管网络的组织工程皮肤支架或许更有优势，此即为预血管化策略。该策略是指在将生物支架植入受体之前，即在内部制备好微血管网络[11]。根据构建方式的不同，可分为体外预血管化和体内预血管化两类。

2.1 体外预血管化构建策略

体外预血管化的构建依然离不开细胞这一重要原料，但是与前文提到的血管生成策略不同的是，负载细胞的支架在移植至受体之前即在体外形成了成熟的毛细血管或血管样结构[64]。因此，当将血管化的支架移植至创面时，能够快速与受体自身血管网进行整合，从而达到早期提供营养支持的目的。Abaci 等[65]通过3D 打印技术，首先在组织工程皮肤支架内部构建出管腔样结构，然后将iPSC 来源的内皮细胞接种至管腔结构中，从而达到在体外构建预血管化组织工程皮肤支架的目的。当将该支架用于小鼠全层皮肤缺损修复时，相较于未预血管化的支架，前者血流灌注明显，新生皮肤结构更加成熟、完整。Hanjaya-Putra 等[66]将内皮集落形成细胞及多种生长因子包被至透明质酸水凝胶支架中，体外培养第2 天即可见成管、出芽等行为的发生，而在第3 天即可见成熟的血管网络。当将这些预血管化的支架植入小鼠皮下时，可见宿主血管网长入支架内部，并与预先建立的血管网络迅速形成吻合，从而达到为组织细胞早期提供营养支持的目的。Kong 等[67]将iPSC来源的内皮细胞与人冠状动脉平滑肌细胞在多孔聚氨酯支架中共培养，发现支架内部形成毛细血管，并在体外可存活3 d。当将其植入宿主体内时，这些预先形成的血管网络同样可与宿主毛细血管形成吻合。

2.2 体内预血管化构建策略

体内预血管化策略是指利用机体本身作为生物反应器，在植入体内的支架中形成新的血管[68]。最简单的方法即将支架植入表浅且血管丰富的组织中，如皮下袋、肌袋。在一定时间内，机体的血管就可随机长入支架中，即完成了支架的预血管化操作。Laschke 等[68]将PLGA 支架植入小鼠皮下，20 d 后将带血管的支架进一步转移至背侧皮肤内，并评估血液灌注及细胞存活情况。结果表明，血管化的PLGA 支架的血液灌注量比未血管化的支架高近20 倍。动静脉环技术也是一种重要的体内预血管化方法[69]。人为构建的动静脉环既可直接提供主要的血液灌注和营养支持，有可以诱导周边小血管的形成。该方式在大体积的组织器官（如乳腺）的修复重建中具有非常广阔的应用前景，但在皮肤缺损修复重建中应用较少。

虽然预血管化策略在构建血管化组织工程皮肤上有其独特的优势，但在实际应用中依然面临诸多挑战。很多支架材料在内部结构设计上没有模拟细胞外基质的特性，孔隙度较小，宿主血管无法长入支架内部。其结果是，在支架内部虽然可见成熟血管的形成，但是无法实现灌注功能。一般认为，支架孔隙率大于70%时，才有较好的促血管生成效果。Choi 等[70]的研究表明，当支架孔径>200 μm 时，有利于形成低密度但是管径较大的血管网络；当支架孔径<200 μm 时，则易形成高密度但是管径较小的血管网络。利用动静脉环技术构建预血管化支架的方式在操作上比较复杂，对机体损伤较大，在临床实际应用中并不常见。目前，关于利用预血管化的方式构建组织工程皮肤的研究报道较少，尚需更多临床前和临床试验评估其临床应用潜力。

3 总结与展望

目前，关于促进组织工程皮肤血管化的研究层出不穷，而且均不同程度达到了促进新生血管化的要求。然而，每种方法的使用均有其局限性。随着对血管形成机制的不断了解和深入，将血管生成策略与预血管化策略进行结合，并设计出模拟天然组织生长环境的支架结构，有望更好地促进组织工程皮肤血管化形成，并投入临床使用。