低温处理对桃种子贮藏物质及抗氧化酶活性的影响

侯小进,张梦,刘克帅,蔡祖国,陈莹莹,王保全

（1.河南科技学院园艺园林学院,河南 新乡 453003；2.新乡市果树研究所,河南 新乡 453006）

桃为蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus L.）的落叶乔木[1],花期为3～4 月,果实成熟期因品种不同而异.桃原产于我国,在河南、河北、浙江、江苏、山东等地区均有栽培.一般北方地区的桃多为硬桃,南方地区的桃多为软桃[2].桃喜光,不耐阴,适宜较温和的气候条件,多生长在光照良好的地方；耐寒、耐旱能力强,忌涝；繁殖方式主要采用嫁接繁殖,可芽接,技术要求高.桃果实中维生素E 含量较高,可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应,从而预防近视[3].

随着生物技术和种质资源的不断发展,植物种子的保存和利用变得愈发重要.在生物学领域,种子作为植物的生殖器官,是保持植物种群进化的载体,同时也是植物繁衍后代的关键.作为植物的重要组成部分,种子内部含有一定的养分和活性成分,这些成分能够为植物发芽、生长等各个阶段提供必需的能量及营养物质.

种子休眠是高等植物普遍存在的现象,是植物长期在特定环境中形成的一种适应性[4],这可能是由于受种皮[5]和抑制物质[6]的影响所致.桃种子同样存在休眠[7],低温处理是目前解除桃种子休眠最常用并且最有效的方法,可以提高其酶活性,从而解除休眠[8-9].种子的休眠及萌发与种子的能量动态显著相关,因此研究桃种子在低温层积解除休眠过程中蛋白质、糖等主要贮藏物质含量和相关酶活性的变化规律,可为实现桃种子种胚发育和萌发进程提供重要的理论支撑.相关研究表明,温度对种子萌发和生长有很大的影响,尤其是低温处理对种子的影响较为显著,在层积处理过程中种子的贮藏物质及抗氧化酶活性会发生一些变化.在4 ℃的低温环境下,种子可以保持相对较高的活性,同时也可以降低种子的呼吸强度和代谢速率.在低温处理过程中,种子能完成种胚成熟,在其内部也会发生一系列的变化,使得种子吸水能力加强,将不溶性的内含物转化为可溶性的简单物质.这主要是因为低温处理能够有效地促进种子解除休眠,增强植物的抗逆性及抗病性能,同时也能提高种子品质.因此,低温处理在植物产业的发展中具有重要的应用价值.本文旨在研究低温处理对桃种子可溶性蛋白、可溶性糖含量以及SOD、POD 和MDA等指标的影响,以期为提高桃种子的质量和活性提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的“锦香”和“秋彤”桃种子,均来自河南省新乡市卫辉市蟠桃园.

1.2 材料处理

将完全成熟的“锦香”和“秋彤”果实进行处理.首先,将果肉去除,取出桃核并将其外面的果肉剔除干净,放在清水中清洗干净,随后放置在阴凉、干燥、通风处,自然堆沤.其次,选择大小形态颜色一致且饱满的桃核进行去硬核处理,将桃种放入清水中浸泡24 h 使之充分吸水,用湿毛巾包裹桃种置于穴盘中,于2023 年2 月1 日放入4 ℃冰箱.期间经常检查并补水,分别于15 d、30 d、45 d、60 d 各取一次样,以未进行低温处理的种子为对照,分别记作CK、15 d、30 d、45 d、60 d.每次取样为30 个桃种,取样后去种皮液氮磨样,置于-80 ℃超低温冰箱保存备用.

1.3 试验试剂

Na2HPO4、NaH2PO4、浓H2SO4、30%H2O2、愈创木酚混合液、核黄素、蛋氨酸、氮蓝四唑、TCA（三氯乙酸）、TBA（硫代巴比妥酸）等.

1.4 测定指标

采用考马斯亮蓝法G250 测定可溶性蛋白含量,采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量,采用氮蓝四唑法（NBT 法）测定超氧化物歧化酶（SOD）含量,采用比色法测定过氧化物酶（POD）含量,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量.

1.5 数据处理

采用Excel 2016 对试验数据进行整理和分析,每个样品设置3 个重复,数据结果用平均值±标准偏差表示,然后用DPS 软件对数据进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 种子低温处理过程中贮藏物质的变化

2.1.1 可溶性蛋白含量变化植物的种子以蛋白质和糖类的形式贮藏营养物质,在种子萌发以及幼苗生长初期可以作为能量的来源.在低温处理过程中,桃种子仍然保持着一定的呼吸作用,其体内的物质会发生分解和复杂的贮藏物质转化等.

图1 结果表明,“锦香”在4 ℃低温处理过程中蛋白质含量整体呈先下降后上升的趋势,在低温处理的15 d 蛋白质含量显著下降,到30 d 以后又开始上升,45 d 时达到高峰.与CK 相比,15 d、30 d 分别下降28.4%和15.7%,差异显著.而45 d 上升3.1%,60 d 下降1.3%,其45～60 d 蛋白质含量变化不明显,无显著差异.“秋彤”在低温处理过程中蛋白质含量变化与“锦香”不同,其变化趋势没有明显规律,蛋白质含量15 d 时先上升,30 d 时下降到最低值,45 d 开始上升,60 d 又趋于下降.其蛋白质含量与CK 相比,15 d 上升3.5%,30 d 下降12.6%,45 d 上升8.0%,60 d 下降6.1%,与CK 差异均未达到显著水平.

图1 低温处理对桃种子可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effect of lowtemperature treatment on soluble protein content of peach seeds

2.1.2 可溶性糖含量变化可溶性糖作为一种贮藏物质,能够为胚芽提供能量和碳源,支持胚芽的生长和发育.在桃种子中,可溶性糖的含量受多种因素如生长环境、种子品种、收获条件等的影响.一般而言,在一定范围内种子中可溶性糖的含量越高,胚芽的萌发率越高.

由图2 可知,“锦香”在4 ℃低温处理过程中整体呈现下降的趋势,对照的可溶性糖含量最高,随着低温层积时间的增加,可溶性糖含量逐渐降低,60 d 时达到最低.可溶性糖含量与对照相比,15 d 时变化较小,仅降低11.2%,未达到显著水平.30 d 时降低14.0%,但是,低温处理的45 d 和60 d,波动较大,分别降低80.9%和84.2%,达到极显著差异水平.“秋彤”在低温处理过程中可溶性糖含量变化规律和“锦香”相同,都呈现下降的趋势,但有一点不同的是,整体含量变化较小,在低温处理的15 d 时仅下降1.1%,30 d 时下降2.3%,4 5d 时下降2.9%,而在低温处理的60 d 时降低5.8%,此时可溶性糖含量最低,与对照均无显著差异.

图2 低温处理对桃种子可溶性糖含量的影响Fig.2 Effect of lowtemperature treatment on soluble sugar content of peach seeds

综上所述,从图2 可看出可溶性糖含量随着层积处理时间的延长其含量逐渐降低,表明在无低温胁迫的情况下,种子萌发率最高,随着低温处理时间的延长,胚芽的萌发率会逐渐降低.此研究结果为桃种子萌发障碍提供了现实的依据.

2.2 种子低温处理过程中抗氧化酶活性的变化

2.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性变化SOD 是一种重要的抗氧化酶,它能够将超氧自由基转化为过氧化氢（H2O2）,从而减少活性氧的产生.此外,SOD 也能够与其他抗氧化酶协同作用,保护细胞免受氧化损伤.在本研究中,低温处理对SOD 活性的影响,可反映种子对环境胁迫的响应能力.

图3 结果表明,“锦香”在4 ℃低温处理过程中,随着层积时间的延长,SOD 活性逐渐下降,在45 d 时SOD 酶活性又开始增加,60 d 时酶活性降到最低,所以整体表现为下降- 上升- 下降.与对照相比,15 d 和45 d 时SOD 酶活性分别下降26.8%和35.5%,60 d 时酶活性最低,下降57.0%.其差异均与对照存在极显著差异.“秋彤”在低温处理过程中,30 d 时酶活性达到最高,与对照相比仅增加9.7%,45 d 时最低,降低31.1%,6 0 d 时下降8.7%.整体表现为下降- 上升- 下降- 上升,整体变化波动较大.与对照相比15 d、30 d、60 d 未达到显著水平,而45 d 存在极显著差异.

图3 低温处理对桃种子SOD 活性的影响Fig.3 Effect of lowtemperature treatment on SOD activity of peach seeds

2.2.2 过氧化物酶（POD）活性变化POD 是一种抗氧化酶,主要存在于植物细胞的质壁分界处,可以清除细胞内过氧化物,减轻环境胁迫带来的氧化损伤.POD 活性的变化,可以反映桃种子细胞壁的抗氧化能力和低温适应性.

由图4 可知,“锦香”在4 ℃低温处理过程中,POD 活性随着低温处理时间的延长逐渐上升,对照POD酶活性最低,在45 d 时达到高峰,增长272.3%,存在显著差异.其酶活性与对照相比在15 d 和30 d 时无显著差异,分别增加17.1%和9.8%.“秋彤”在低温处理过程中,POD 活性表现出上升- 下降- 上升的规律,对照POD 活性最低,在15 d 时显著增加,其POD 活性增加159.8%,在30 d 时增加28.5%,其活性与15 d 时相比显著下降,而在45 d 和60 d 时增加.综上可知,“锦香”和“秋彤”的POD 活性都表现出最低,呈现出共同的特点.

图4 低温处理对桃种子POD 活性的影响Fig.4 Effect of lowtemperature treatment on POD activity of peach seeds

2.2.3 丙二醛（MDA）含量变化MDA 是脂质过氧化物的代表物质之一.桃种子中含有MDA,因为桃种子中含有脂质,脂质有可能会在存储或处理过程中发生氧化反应,产生MDA 等脂质过氧化产物.因此,在对桃种子进行保鲜和贮藏等过程中,需要注意避免氧化反应的发生,以降低MDA 等脂质过氧化产物的含量.

由图5 可知,“锦香”在4 ℃低温处理过程中,表现为上升- 下降- 上升的变化趋势,在45 d 时下降到最低值,60 d 时又有显著上升,且达到最高值.MDA 含量与对照相比,45 d 时下降49.1%,60 d 时上升136.44%,差异显著.“秋彤”在低温处理时MDA 含量变化趋势与“锦香”不同,整体表现为先下降后上升的变化规律,对照MDA 含量最高,30 d 时达到最低值,与对照相比下降28.8%.整体变化波动较小,说明“秋彤”MDA 含量对低温反应不敏感,无显著差异.

图5 低温处理对桃种子MDA 含量的影响Fig.5 Effects of lowtemperature treatment on MDA content of peach seeds

3 结论与讨论

3.1 结论

本试验中,“锦香”和“秋彤”可溶性蛋白经过低温处理后先下降,分别在低温处理的30 d 和45 d 开始上升,均在45 d 时达到最大值,而后下降.蛋白质含量增加是由一些应激响应蛋白受到低温等环境刺激所造成的.可溶性糖含量随低温处理时间的延长而下降,原因是种子内的可溶性糖被分解为其他产物.

SOD 与对照相比均呈现为下降趋势,分别在45 d 和30 d 时酶活性为最低,POD 表现为上升- 下降-上升- 下降,但经过低温处理POD 酶活性均高于对照.“锦香”MDA 含量在低温处理60 d 表现为上升,“秋彤”表现为下降,其整体变化甚微,但都在45 d 时酶活性最低.低温处理可能会改变细胞膜的特性,从而影响其活性.

3.2 讨论

植物低温处理的研究一直备受关注,特别是在农业、林业等领域具有重要的地位[10].上述研究表明,可溶性蛋白、可溶性糖作为植物渗透调节物质,通过分解或积累物质达到调节细胞渗透平衡的作用,从而缓解低温对植物造成一定的伤害[11].可溶性蛋白是桃种子中的重要成分,是桃种子生长和发育过程中必不可少的营养物质；低温处理对桃种子贮藏物质含量产生一定的影响,“锦香”和“秋彤”种子都在低温处理的45 d 时达到最高值,60 d 时与对照相比又下降, 这与色木槭和茶条槭可溶性蛋白含量变化相一致[12],在45 d 时升高可能是低温处理后与种子萌发相关的蛋白增加,而较长时间低温处理会导致桃种子内细胞代谢减缓,因此可溶性蛋白的含量下降.“锦香”和“秋彤”可溶性糖含量变化规律完全一致,都呈现出下降的趋势.这与廖云娇[13]等对东北红豆杉、李秋琦等[14]与黄儒珠等[15]对南方红豆杉的研究结果不一致.低温抑制了糖的合成和代谢过程,但与品种有关,“锦香”下降剧烈,“秋彤”变化较小.可溶性糖是一种重要的植物营养物质,在种子中也起到重要的作用,它是一类可以溶于水的糖类化合物,包括单糖、双糖和多糖,在胚芽萌发的早期,可溶性糖会被转化为葡萄糖,这也正是胚芽所需要的能量来源.总之,桃种子中的可溶性糖是一种重要的贮藏物质,其可溶性糖含量随着低温处理时间的延长逐渐降低,说明低温会抑制糖的合成和代谢过程.一定范围内,可溶性糖含量越高,种子萌发率越高[16].可溶性糖还具有调节作用,能够影响植物的生长,因此可溶性糖的作用不可忽视.

在低温处理过程中,桃种子SOD 变化规律各不相同.“锦香”种子在60 d 时活性最低,而“秋彤”种子在45 d 时最低.蒋丽娟等[17]认为,种子萌发率随低温层积时间的延长而增加,SOD 活性会逐渐下降.说明低温处理导致SOD 蛋白质的构象发生变化,导致失去原有的抗氧化活性；在低温环境下代谢缓慢,细胞及组织内的氧气浓度增加导致氧化损伤.POD 活性与对照相比均表现为显著的升高, 这与云南重楼POD 活性变化规律相一致[18],说明低温处理促进桃种子POD 活性的提高.在低温条件下,桃种子代谢缓慢,导致POD 底物积累, 同时也会改变桃种子内部的环境因素等.POD 活性的增高可以减轻低温胁迫造成的损伤[19].同时POD 可以进一步清除H2O2,从而有效减少自由基对细胞膜造成的伤害[20].“锦香”MDA 含量在低温处理的初期逐渐上升,45 d 时剧烈下降,60 d 时达到峰值,低温处理引起桃种子细胞膜损伤和氧化应激,从而导致MDA 含量升高.此外,还可能导致种子代谢异常,对能量代谢和酶催化等过程产生干扰.“秋彤”MDA 含量则表现轻微下降,但整体处于平稳趋势.低温处理导致“锦香”MDA 含量上升,而“秋彤”表现为下降,其变化规律不同可能与品种有关.其MDA 具有很强的细胞毒性,也是衡量膜系统受害的重要指标[21].当植物体受到的损伤越大,其体内的MDA 含量越多[22].低温处理可以提高桃种子中抗氧化酶的活性,包括过氧化物酶可以消除种子内部的自由基和有害物质,保护种子的细胞膜和细胞器的完整性,从而增强种子的抗逆性和耐贮存性.

总之,4 ℃低温处理已经被证明是一种较为有效的方法.研究表明,采用4 ℃低温处理可以防止桃种子的氧化变质.此外,4 ℃低温处理还可以有效提高桃种子中多种抗氧化酶的活性,从而增强种子的抗氧化能力,提高其品质和营养价值.因此将4 ℃低温处理应用于桃种子贮藏中,可以有效提高种子的储存能力,为其后续的开发和利用提供更大的保障.同时,在对桃种子进行低温处理时,需要综合考虑种子发芽率、水分含量和质量损失、营养成分等因素的影响,以确保种子品质的稳定.同时,在实际生产中,应适当调整低温处理的温度和时间,以达到最佳的处理效果.

综上,本研究为进一步探究低温处理对桃种子的影响提供了新的思路,具体可以从以下方面展开研究：

（1）低温处理时间的影响：目前研究的低温处理时间一般较短,而长时间的低温处理可能会对种子的存活和发芽产生不利的影响,因此需要进一步研究低温处理时间对桃种子贮藏物质及抗氧化酶活性的影响.

（2）不同温度处理的影响：除了4 ℃低温处理外,设置不同的温度处理也可能对桃种子的贮藏物质和抗氧化酶活性产生影响.

（3）深入探索低温处理对桃种子存活率和萌发能力的影响机制.

（4）桃种子贮藏条件的优化：在桃种子的贮藏过程中,除了低温处理外,还需要考虑其他的贮藏条件,如湿度、氧气含量等,因此可以进一步研究不同贮藏条件对桃种子的影响以及如何优化贮藏条件,提高种子的存活和发芽能力.

这些研究方向将进一步深化低温处理对桃种子影响的认识,为提高桃种子生产效率和质量提供更有力的理论指导,为桃的种植、贮藏和利用提供有益的参考和指导.未来还可以从多方面深入研究低温处理的作用及机制,为果树产业的发展提供更多支持,以推动行业的可持续发展.