实验教学中醋酸纤维素薄膜电泳的条件优化

武丽涛, 李梦瑶, 宁启兰, 吴 锋, 杨旭东, 闫小飞, 蒋小英, 蒋晓刚, 李冬民

(1.西安交通大学 医学部基础医学院生物化学与分子生物学系,陕西 西安 710061; 2.西安交通大学 医学研究生教学实验中心,陕西 西安,710061)

在医学高等教育体系下,实验教学连接理论教学与学生实践,对于培养学生的创新型综合素质起着至关重要的作用[1]。生物化学是医学及生物学专业学生必须掌握的基础课程,推进对生物化学实验教学的改革[2],可以有效促进学生对理论知识的掌握并提高学生的团结协作精神[3]。

蛋白质的分离是蛋白质章节的一项重要内容[4]。使用水平电泳分离血清蛋白是形象反映蛋白质组成的一项重要实验技术,奠定了生物化学蛋白质特性的基础。蛋白质在高于或低于其pI的溶液中成为带电颗粒,在电场中能向正极或负极方向移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术即为电泳[5]。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上,薄膜两端分别加正、负电极,此时带正电荷的蛋白质向负极泳动;带负电荷的蛋白质向正极泳动,通过移动速度的不同将其形成多条蛋白区带,达到分离效果[6]。近年来,多地开展的醋酸纤维素薄膜电泳,由于实验方法的不同,且实验过程中的影响因素较多,学生获得的实验结果也存在多种问题,比如条带无法分离,分离出少于5条条带以及条带歪歪扭扭的情况[7-8]。因此,西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系针对目前存在的问题,经过多年探索,摸索出了成功分离血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳技术的实验条件。

1 实验材料与器材

1.1 实验材料

1.1.1 pH 8.6 巴比妥缓冲液：称取巴比妥钠12.76 g,巴比妥1.66 g,蒸馏水加热溶解后,定容至1000 mL。

1.1.2 pH 8.6 氯化钠-NaOH缓冲液：称取氯化钠1.5 g溶于1000 mL蒸馏水中,后加入1 mL的1 mol/L NaOH。

1.1.3 pH 8.6 甘氨酸-NaOH缓冲液：称取甘氨酸3.75 g溶于蒸馏水中,加入20 mL 0.2 mol/L NaOH,定容至1000 mL。

1.1.4 氨基黑染色液：称取氨基黑10 B 0.5 g,溶解于50 mL甲醇中,后加冰醋酸10 mL及蒸馏水40 mL。

1.1.5 漂洗液：量取冰醋酸100 mL,加蒸馏水定容至1000 mL。

1.1.6 正常人血清,由西安交通大学第二附属医院检验科提供。

1.1.7 大鼠及小鼠血清,由西安交通大学医学部实验动物中心提供。

1.2 实验器材

卧式水平电泳仪(北京六一,DYCP-38C),直流稳压电源(北京六一,DYY-6C),醋酸纤维素薄膜(成都菲尔斯特仪器有限公司,规格为2 cm×8 cm),滤纸,胶头滴管,载玻片,订书针,钢尺,镊子,铅笔等。

2 实验方法

2.1 电泳装置的搭建

在实验开始前的准备工作中,实验技术老师提前完成电泳装置的搭建。具体来说：裁剪50 cm×8 cm的滤纸,纵、横各折叠一次后,搭建滤纸桥,如图1所示[9]。在水平电泳槽中按照指示刻度线添加电泳缓冲液,待滤纸全部浸湿后,即可进行后续电泳操作。

图1 水平电泳仪横截面滤纸桥搭建示意图

2.2 醋酸纤维素薄膜的预处理

将醋酸纤维素薄膜用镊子小心夹出,无光泽的糙面朝上放置在干净的滤纸上。距离一端1.5 cm处,用铅笔画一条线以作点样标记,同时学生按照分组标记编号以便区分,如图2所示。随后,将醋酸纤维素薄膜放置在pH 8.6 的电泳缓冲液中浸泡约20 min[10]。浸泡结束后,将膜取出,滤纸吸取表面多余水分,将膜无光泽面朝上放置备用。

图2 醋酸纤维素薄膜画线及点样示意图

2.3 点样的选择及优化

胶头滴管吸取一滴样品(血清)于载玻片上,用盖玻片的一侧(玻片宽度应小于薄膜的宽度)蘸取适量样品(样品吸附高度约2 nm,且高度均一),然后将取样截面与薄膜画线位置轻轻接触,完成点样。点样动作要轻柔,确保样品点的细窄且均匀,位置适中[11]。在实验过程中我们分别使用了玻片、订书针及钢尺进行点样,实验结果并未观察到有明显差异,因此后续实验我们可以选择较为经济的玻片进行点样。

2.4 电泳检测

将点好样的醋酸纤维素薄膜用镊子轻轻夹取,无光泽面朝下,点样端靠近阴极,两端搭在滤纸桥支架上。待薄膜在电泳槽中平衡5～10 min后,接通电源,调节电压为120 V,恒压电泳60 min后即可停止电泳[12]。

2.5 蛋白质的染色与背景脱色

用镊子将薄膜从电泳槽中取出,放置在氨基黑染色液中,染色3 min,然后移入10% 冰醋酸漂洗液中进行漂洗脱色,共漂洗3次,每次5 min,直至薄膜可以清晰观察到条带,且背景干净[13]。

2.6 条带观察与分析

将薄膜从漂洗液中取出,用滤纸吸去表面多余的液体,观察不同来源的血清(人、大鼠、小鼠)经电泳后分离的蛋白区带。

3 结果与分析

3.1 不同的缓冲液对血清蛋白分离的影响

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中成为带电的颗粒,在电场中能向正极或负极方向移动。我们通过对比以下三种不同的pH 8.6缓冲液来筛选最适于分离血清蛋白的实验条件。图3A～3C分别为：pH 8.6巴比妥缓冲液、pH 8.6氯化钠-NaOH缓冲液[13]以及pH 8.6甘氨酸-NaOH缓冲液[14]。实验结果显示,在巴比妥缓冲液中,血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳分离可见5条清晰条带。在氯化钠-NaOH缓冲液中只有部分薄膜可以分离得到条带,且无法看到明显的5条条带。而在pH 8.6甘氨酸-NaOH缓冲液中,血清蛋白无法在醋酸纤维素薄膜电泳下观察到分离的条带。即经过三种不同缓冲液的对比,我们可以发现,pH 8.6的巴比妥缓冲液是醋酸纤维素薄膜电泳中分离血清蛋白的最佳缓冲液。

图3 不同缓冲液对血清蛋白分离的影响

3.2 不同电压对血清蛋白分离的影响

我们进一步观察了不同电压对醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白的影响。设立三组电压进行比较,分别为：100 V、120 V及140 V,实验结果如图4A～4C所示。从三种电压下分离的条带可以看出,100 V电压分离的条带没有完全分离开且不清晰,140 V电压分离的条带出现了严重的拖尾现象,只有120 V电压下分离的条带清晰且一目了然。因此,120 V是醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白的最佳电压。

图4 不同电压对血清蛋白分离的影响

3.3 不同血清蛋白样本应用于实验教学效果的分析

血清蛋白的分离应用于实验教学中,旨在让医学专业的本科生形象直观地了解电泳技术的原理及操作,了解分离蛋白质等生物大分子技术在临床疾病诊断中的实际应用。在以往的实验教学中,常常以人血清作为实验材料。然而,从人血清的获取困难性以及操作安全性方面考虑,笔者在本实验中尝试使用正常健康的大鼠和小鼠血清作为对比,研究是否可以将安全的小动物血清大面积应用于实验教学,从而代替使用人血清所存在的安全隐患。如图5所示,笔者分别使用了人血清、大鼠血清以及小鼠血清进行醋酸纤维素薄膜分离蛋白实验,结果显示,在pH 8.6的巴比妥缓冲液中,以120 V电压电泳60 min均可以分离得到清晰的5条条带。考虑到大鼠血清体积明显多于小鼠血清,且比人血清更容易获得,因此,在后续的实验教学中笔者将健康的大鼠血清作为醋酸纤维素薄膜分离血清蛋白的实验材料。

图5 不同样本应用于实验教学中的分离效果

3.4 优化后大鼠血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳的分离效果

大鼠血清蛋白的等电点低于pH 7.0,在pH 8.6的巴比妥缓冲液中进行电泳,电泳条件为120 V电泳60 min,可将大鼠血清蛋白分为清蛋白、α1、α2、β以及γ-球蛋白5条区带,如图6所示。进一步分析可得各部分蛋白所占的比例：清蛋白为57%～72%;α1-球蛋白为2%～5%、α2-球蛋白为4%～9%、β球蛋白为6.5%～12%以及γ-球蛋白为12%～20%[15-17]。

图6 醋酸纤维素薄膜电泳分离大鼠血清蛋白电泳图谱

4 结语

本实验优化了电泳缓冲液的选择、电压的大小以及血清样本的选择等实验步骤,保障了实验的可操作性及实验结果的可重复性,条带再现性一致。这一实验也使得学生掌握了蛋白质结构及特点这一章节的理论知识,加深了对蛋白质特性的理解。蛋白质电泳的成功分离,更有助于激发学生的实验热情和科研动力,锻炼了学生的动手能力及探索科学问题、解决科学难题的能力,对培养创新型科研人才起到了积极的作用。