丹参多酚酸盐调控NF-κB信号通路对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响 *

彭兴华 李章红 罗 列

（赣州市人民医院心脏外科，江西 赣州 341000）

冠心病是临床常见的心血管疾病，由冠状动脉粥样硬化引起的血管狭窄和阻塞所致。最常见的特征是心肌供血不足从而致使心脏缺血缺氧，甚至会导致一些心肌细胞的死亡［1］。该病严重威胁着患者的生命健康安全，更有甚者会导致猝死。近年来，中医技术发展迅速，在治疗冠心病方面，其效果在一定程度上较西医更好［2］。目前，一些学者［3］发现，丹参中可以提取出一种名为丹酚酸盐的成分，它可抵抗氧化自由基、抵抗血栓形成，对心血管系统有着较好的保护作用。此外，NF-κB通路是一种炎症信号，是一种既能稳定心脏内环境，又能介导致病特异性反应的转导途径［4］。但并未有研究指出丹参多酚酸盐可以调控NF-κB 通路对冠心病心肌细胞凋亡有影响。因此，本研究就丹参多酚酸盐对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制进行探讨，以期为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选取60 只健康雄性SD 大鼠，体质量260 g 左右，饲养于无菌环境中（温度：27 ℃左右；湿度：55%左右），自由进食，适应性喂养1 周后进行实验。将其随机分为对照组、模型组、阳性对照组、丹参多酚酸盐低剂量组、丹参多酚酸盐中剂量组、丹参多酚酸盐高剂量组，每组10只。

1.2 实验药品高脂饲料（江苏协同生物工程有限责任公司，20210712），垂体后叶素（南京新百药业有限公司，150902），注射用丹参多酚酸盐（上海绿谷制药有限公司，国药准字Z20050247），瑞舒伐他汀钙片（浙江海正药业股份有限公司，H20143339）。

1.3 实验试剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（武汉塞维尔生物科技有限公司，G1017），苏木精染色液（北京雷根生物科技有限公司，DH0041），ELISA 试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，20200516），生理盐水（石家庄四药有限公司，1901023203），超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（上海邦奕生物科技有限公司，20201023），丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，20200504），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0012），脱脂奶（美国BD 公司，232100），鼠抗NF-κB p65、NF-κB 抗体、β-actin 抗体（北京博奥森生物技术公司，bs-23216R、bs-3543R、bs-0061R），PCR检测试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司，AG11708-S）。

1.4 实验方法通过喂食高脂肪饮食并腹腔注射垂体后叶素建立模型。在连续6 周每天喂食高脂饲料后，每隔24 h 腹腔注射30 µg/kg 垂体后叶素，连续3 次。丹参多酚酸盐低、中、高剂量组分别给予50、150 和450 mg/L注射用丹参多酚酸盐，阳性对照组给予10 mg/kg 瑞舒伐他汀钙片，对照组采用常规饮食。

1.5 检测指标

1.5.1 心肌梗死面积测定处死大鼠取出心脏并切片，未染色的组织为危险区（AAR），分离后称重并在TTC溶液中孵育。染色后，正常心肌组织变为砖红色，而梗死心肌组织（IS）为灰白色。分离、称重IS，并计算IS/AAR以反映心肌梗死的大小。

1.5.2 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况收集的组织用石蜡包埋、切片并用苏木精染色。然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡和洗涤2 次，向切片中加入50 µL TUNEL 反应混合物，后用PBS 洗涤3 次，并在倒置显微镜下观察组织细胞的凋亡情况，并计算凋亡率。

1.5.3 ELISA检测心肌组织中炎性因子含量取心肌组织制备成匀浆，在4 ℃下以3000 r/min 离心10 min（离心半径8.5 cm）。收集上清液，用ELISA 试剂盒检测上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。

1.5.4 检测心肌组织SOD、MDA含量在预冷的生理盐水中冲洗心肌组织，去除血液，用手术剪刀切断心肌组织块，并转移至匀浆管，制成组织浆。3000 r/min 离心10 min（离心半径8.5 cm）后，取上清液，根据每个试剂盒的说明检测心肌组织的SOD活性和MDA含量。

1.5.5 WB检测心肌组织相关蛋白含量取心肌组织加入组织蛋白提取物，4 ℃充分研磨，10 000 r/min 离心10 min（离心半径10 cm），取上清。用BCA 蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量。定量的蛋白样品在凝胶电泳前煮沸变性，脱脂奶粉密封闭1 h，加入一抗孵育过夜，漂洗后标记二抗反应，发光显色，凝胶成像仪曝光摄影。检测NF-κB p65、NF-κB蛋白表达。

1.5.6 PCR检测心肌组织NF-κB p65、NF-κB mRNA表达收集组织，然后加入RNAiso plus以提取总RNA，然后按照反转录试剂盒说明配置反转录体系以制备cDNA。通过20 µL 定量聚合酶链式反应体系，通过定量PCR 仪扩增目的基因。以β-actin为内参，计算目的基因的相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0统计分析软件，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠IS/AAR情况比较与对照组比较，模型组IS/AAR 较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组IS/AAR 较低（P＜0.05），且随着剂量的升高而降低；丹参多酚酸盐高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（F=98.604，P＞0.05）。见表1。

表1 6组冠心病模型大鼠IS/AAR情况比较（± s）

表1 6组冠心病模型大鼠IS/AAR情况比较（± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组IS/AAR 0 0.79±0.101）0.52±0.092）0.40±0.082）0.20±0.062）0.20±0.052）鼠数10 10 10 10 10 10

2.2 6 组大鼠心肌组织细胞凋亡情况比较与对照组比较，模型组凋亡率较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组凋亡率较低（P＜0.05），且随着剂量的升高而降低；高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（F=209.506，P＞0.05）。见图1、表2。

图1 6组冠心病模型大鼠心肌组织细胞凋亡情况比较（×400）

表2 6组冠心病模型大鼠心肌组织细胞凋亡情况比较（± s，%）

表2 6组冠心病模型大鼠心肌组织细胞凋亡情况比较（± s，%）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

凋亡率2.35±0.20 42.69±5.411）36.84±4.392）28.69±2.572）20.06±51.632）20.00±1.052）组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组鼠数10 10 10 10 10 10

2.3 6 组大鼠炎性因子水平比较与对照组比较，模型组炎症因子水平较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组炎症因子水平较低（P＜0.05），且随着剂量的升高而降低；高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 6组冠心病模型大鼠炎症因子水平比较 （± s，ng/L）

表3 6组冠心病模型大鼠炎症因子水平比较 （± s，ng/L）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

TNF-α 4.48±1.06 80.47±3.151）62.50±2.542）50.05±3.052）24.41±3.152）24.00±3.602）组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组鼠数10 10 10 10 10 10 IL-1β 0.85±0.18 8.15±0.221）6.28±0.412）4.84±0.262）3.02±0.202）3.00±0.162）IL-6 14.15±1.51 68.12±5.691）52.09±4.712）40.96±4.082）31.77±3.082）31.05±3.692）

2.4 6 组大鼠SOD活性及MDA含量比较与对照组比较，模型组SOD较低，MDA 较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组SOD 较高，MDA 较低（P＜0.05）；高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 6组冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比较（± s）

表4 6组冠心病模型大鼠SOD活性及MDA含量比较（± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组MDA/（nmol/mg）8.02±1.25 16.41±3.521）14.36±3.402）12.47±3.072）10.42±1.512）10.40±1.062）鼠数10 10 10 10 10 10 SOD/（U/mg）120.42±5.42 60.54±4.081）78.62±4.922）86.97±6.572）92.51±8.022）92.50±8.562）

2.5 6 组大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表达比较与对照组比较，模型组NF-κB p65、NF-κB 蛋白表达较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组NF-κB p65、NF-κB 蛋白表达较低（P＜0.05）；高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5、图2。

图2 6组冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表达比较

表5 6组冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表达比较（± s）

表5 6组冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB蛋白表达比较（± s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组NF-κB 0.41±0.10 1.52±0.121）1.21±0.112）0.92±0.082）0.71±0.052）0.70±0.072）鼠数10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 0.30±0.09 1.23±0.101）1.06±0.082）0.82±0.062）0.62±0.042）0.60±0.062）

2.6 6 组大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表达比较与对照组比较，模型组NF-κB p65、NF-κB mRNA 表达较高；与模型组比较，丹参多酚酸盐各剂量组NF-κB p65、NF-κB mRNA 表达较低（P＜0.05）；高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6 6组冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表达比较（± s)

表6 6组冠心病模型大鼠NF-κB p65、NF-κB mRNA表达比较（± s)

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

组别对照组模型组丹参多酚酸盐低剂量组丹参多酚酸盐中剂量组丹参多酚酸盐高剂量组阳性对照组NF-κB mRNA 1.00±0.05 5.05±1.021）4.05±0.852）3.16±0.502）2.74±0.322）2.70±0.352）鼠数10 10 10 10 10 10 NF-κB p65 mRNA 1.00±0.06 3.22±0.501）2.85±0.412）2.03±0.322）1.85±0.262）1.82±0.272）

3 讨论

冠心病是全球死亡率最高的疾病，丹参多酚酸盐是中药丹参最重要的有效成分，具有活血化瘀的作用，现广泛用于冠心病、心绞痛等心血管疾病［5］。此外，还有研究［3］认为，该药物联合瑞舒伐他汀可抑制机体血小板聚集；而该药在一定程度上还能促进血管的舒张、增加其通透性，避免心肌细胞异常现象的发生，从而保证心肌供血供氧。因此文章进行了以下探讨。

在本研究中，对各组大鼠IS/AAR 进行了观察，结果显示模型组IS/AAR 最高，丹参多酚酸盐可改善IS/AAR，同样在对心肌细胞的凋亡中也发现丹参多酚酸盐可以改善心肌细胞凋亡，表明丹参多酚酸盐对冠心病的保护作用与改善凋亡有关，通过减少心肌细胞凋亡从而改善急性心肌梗死后远期心功能［6］。除此之外，有研究［7］表明冠心病最主要的病理基础就是炎症反应，它在该病出现血管损伤时扮演着重要的角色。而在本研究的炎症因子水平观察中也验证了模型组炎症因子水平最高，丹参多酚酸盐可降低炎症因子水平这一结论。因此，抑制炎症反应中炎性因子释放非常关键，而NF-κB 信号通路是抑制炎症相关通路，早就有研究［8，9］发现，丹参多酚酸盐注射液可以有效抑制炎症因子的释放和NF-κB 信号通路的活化，抵抗机体氧化应激反应。SOD 一般在机体中存在范围较广，也是清除心肌组织氧化自由基的重要指标。MDA则是氧自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的最终产物，还可以间接地反映出细胞的损伤程度［10，11］。在本研究中，也发现丹参多酚酸盐可以提高大鼠SOD 水平，降低MDA含量，与其结论一致。而在NF-κB信号通路相关蛋白及基因表达的检测中，结果也显示模型组NF-κB p65、NF-κB 蛋白及mRNA 表达最高，丹参多酚酸盐可降低NF-κB p65、NF-κB蛋白及mRNA表达，提示丹参多酚酸盐可通过抑制NF-κB 通路传导途径，降低炎症因子释放以及氧化应激损伤来达到保护心肌细胞的目的。

综上所述，丹参多酚酸盐可有效抑制冠心病大鼠心肌细胞凋亡，降低心肌梗死面积，改善氧化应激损伤，这可能是通过调控NF-κB 通路实现的，为冠心病的临床治疗提供了新的思路与理论研究支撑。