恒温和变温模式下不同施肥黄壤有机碳矿化特征及其影响因素

朱鑫宇，卢 韦，李 渝，肖 琼，王 妍，邬 磊*，张文菊

（1 青岛农业大学资源与环境学院，山东青岛 266000；2 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 /北方干旱半干旱耕地高效利用全国重点实验室 / 农业农村部耕地质量监测与评价重点实验室，北京 100081；3 农业农村部贵州耕地保育与农业环境科学观测实验站，贵州贵阳 550006）

土壤有机碳 (SOC) 库是陆地生态系统中最大的碳库[1]，也是全球碳循环的重要组成部分，与土壤肥力和全球气候变化密切相关[2-3]。SOC 矿化与土壤养分元素释放和温室气体排放密切相关，其CO2释放速率也是反映土壤质量状况的重要指标[2,4]。SOC 矿化受其化学结构、养分有效性、微生物活性、土壤温度、湿度和质地等多种因素的影响。施肥是调控农田土壤肥力的主要措施，显著影响土壤团聚体结构、SOC 含量、养分有效性和微生物活性等土壤物理化学及生物学性质，从而影响SOC 矿化过程[5]。目前国内外学者在施肥对SOC 矿化的影响方面开展了大量研究工作。苗淑杰等[6]认为，单施化肥、有机肥和有机无机肥配施均显著提高黑土SOC 的矿化速率，李梦雅等[7]和张旭博等[8]在红壤上的研究结果也发现了类似的规律，长期施用有机肥或者有机无机肥配施通过提高微生物的活性促进 SOC 矿化，释放的CO2量较施用化肥处理明显提高。

温度也是影响SOC 矿化的重要环境因素之一[9]。通常认为，SOC 矿化速率随温度升高而提高[10-11]。也有研究表明在较低的温度范围内，温度升高显著促进SOC 矿化，在较高的温度范围内，温度升高对SOC 矿化的促进作用有限[12]。在农田、草地和森林等生态系统中，温度随着昼夜更替周期性变化。然而，目前大部分研究主要是基于恒温室内培养实验分析温度对SOC 矿化的影响，关于温度周期性变化如何影响SOC 矿化特征存在很大的不确定性[10]。部分研究结果表明，恒温和变温模式对不同施肥土壤SOC 矿化的影响程度不同[13]。有研究发现，在恒温模式下不施肥与有机无机肥配施处理的SOC 累积矿化量无显著差异，但是变温模式下不施肥处理SOC 累积矿化量显著高于有机无机肥配施处理[14]。因此，比较分析长期施肥下SOC 矿化对恒温和周期性变温的响应，对于深入理解农田土壤碳周转和肥力提升具有重要意义。

本研究通过采集贵州省农业科学院内旱作黄壤长期定位施肥试验的不同施肥处理土壤样品，采用室内控制实验研究不同长期施肥处理SOC 矿化对温度模式(恒温vs 变温)的响应及其主要控制因素，以期为深入理解农田SOC 矿化特征和优化农田碳管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与样品采集

供试土壤样品采自贵州省贵阳市花溪区贵州省农业科学院内的长期定位施肥试验田 (106°07′E，26°11′N)。试验地隶属贵州省农业科学院土壤肥料研究所，年均温15.3℃，年平均日照时数1354 h，全年无霜期270 天，年降雨量1100～1200 mm。试验地1995 年建成，土壤类型为旱地黄壤，成土母质为三叠系灰岩和砂页岩残积物，种植模式为单季玉米。玉米于4 月中旬播种，8 月中下旬收获，玉米秸秆及根茬直接还田，其余时间休闲。本研究依托长期定位试验，采集4 个施肥处理的耕层土壤样品：不施肥 (CK)、单施化肥 (NPK)、单施有机肥 (M)和有机无机肥配施 (NPKM)。NPK 处理为施用常量化肥氮磷钾，M 处理为施用常量有机肥，NPKM 为施用常量有机肥+常量氮磷钾。供试化肥主要为尿素(含N 46%)、过磷酸钙(P2O516%)、氯化钾(K2O 60%)，每年施用量为N 165 kg/hm2、P2O582.5 kg/hm2、K2O 82.5 kg/hm2。有机肥为新鲜牛粪(含水量67.0%，C 10.4%、N 2.70 g/kg、P2O51.30 g/kg、K2O 6.00 g/kg)，施用量为30.5 t/hm2。肥料全部在玉米季施用，播种前磷钾肥或有机肥作基肥一次性施入，氮肥在玉米生长季作为基肥施用量N 89.0 kg/hm2，玉米苗期追施N 32.0 kg/hm2，喇叭口期追施N 44.0 kg/hm2。试验初始土壤基本理化性质为：有机碳25.75 g/kg，全氮2.03 g/kg，碱解氮167.1 mg/kg，全磷2.39 g/kg，有效磷17.0 mg/kg，全钾 15.8 g/kg，速效钾 110 mg/kg。2017 年8 月下旬玉米收获后，在样地内沿“S”形多点采集耕层 (0—20 cm)土壤样品并均匀混合，去除土壤样品中的根系及可见有机物残体，于室内自然风干后，过8 mm 筛，用于土壤理化指标测定及矿化培养试验。

1.2 试验方法

称取30.0 g 各施肥处理的风干土壤样品于500 mL玻璃培养瓶中，调节土壤含水率至60% 田间持水量，放入15℃的避光培养箱中进行7 天预培养。预培养结束后，在每个培养瓶内放入一个盛有10 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液的小型玻璃杯，用于吸收SOC矿化释放的CO2，然后快速加盖密封。设置2 种培养温度模式：恒温15℃培养 (CT) 和周期性变温 (VT，按照10℃→15℃→20℃→15℃→10℃的顺序匀速变温，每6 h 变化5℃，24 h 为一个循环周期) 培养。将装有土壤样品和NaOH 溶液的玻璃培养瓶分别放入温度设置不同 (CT、VT) 的培养箱中进行避光培养。每个施肥处理下设置4 个重复，每个培养温度下设2 组空白对照(仅装有NaOH 溶液的玻璃培养瓶)，在培养的第1、2、3、4、8、16、24 和32 天更换新的碱液玻璃杯。吸收CO2的碱液玻璃杯快速密封，然后用去离子水稀释5 倍，用封口膜封住瓶口，上总有机碳(TOC)自动分析仪 (Phoenix 8000) 测定，根据TOC 仪器的测定值计算出CO2的释放量。整个培养过程中保证土壤含水量维持在60%田间持水量。

土壤有机碳矿化速率计算公式[15]为:

式中：CO2-C 为培养期间SOC 矿化速率[C mg/(kg·d)]；V0 为空白标定时消耗的标准盐酸的体积(mL) ；V为样品滴定时消耗的标准盐酸的体积 (mL) ；CHCl为样品滴定时消耗的标准盐酸的浓度 (mol/L) ；m为干土重 (g) ；t为更换碱液时间间隔。

变温相对于恒温模式下CO2累积排放量的变化率：

式中：ΔC 为变温相对于恒温模式下CO2累积排放量的变化率 (%)，下文中用ΔCO2表示；CVT、CCT分别为变温和恒温培养下CO2累积排放量 (C mg/kg)。

1.3 测定指标与方法

土壤pH 采用pH 计测定，水土质量比为2.5∶1；土壤有机碳 (SOC) 采用重铬酸钾氧化法测定；全氮(TN) 采用半微量凯氏定氮法测定；全磷 (TP) 采用碱熔—钼锑抗比色法测定；有效磷 (AP) 采用NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定；采用湿筛法将采集的土壤样品分为大团聚体(250～2000 μm)、微团聚体(53～250 μm)和粉粘粒(＜53 μm)组分；土壤微生物生物量碳氮 (MBC 和MBN) 采用氯仿熏蒸—硫酸钾浸提法测定[16]；易氧化有机碳 (EOC) 采用高锰酸钾浸提—分光光度计法测定[17]；β 葡萄糖苷酶(βglucosidase, BG)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)、氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)、亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase.LAP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase, AP)采用96 孔深孔板法测定[18]，利用4-甲基伞型酮-β-D-葡萄糖苷酶 (4-methylumbelliferyl-β-D-glucopyranoside) 做BG 底物，纤维二糖苷(4-methylumbelliferyl β-Dcellobioside)做CBH 底物，4-甲基伞型酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-Dglucosaminide)做NAG 底物，L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐(L-leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride)做LAP 底物，4-甲基伞型酮磷酸盐(4-methylumbelliferyl phosphate)做AP 底物，操作步骤如下：测定土壤pH，用于调节缓冲液pH，称取1.00 g 鲜土加入125 mL 50.0 mmol/L 的醋酸钠缓冲溶液, 在样品孔中加入200 μL 土壤悬液和50.0 μL的相应底物, 在标准物质孔中加入50.0 μL 浓度为10.0 μmol/L 的标准物质和200 μL 的醋酸钠缓冲液，每个样品6 个重复。在黑暗避光条件下, 放置在相应培养温度的恒温培养箱中，孔板放入25℃黑暗条件下培养4 h，为了终止反应，在每个孔中加入10 μL 1 mol/L 的NaOH 溶液，反应1 min 后使用酶标仪测定荧光值。利用多功能酶标仪 (Synergy H4, Bio Tek)在365 nm 处进行荧光激发，450 nm 处荧光检测。

土壤酶活性[A, nmol/(g·h)] 计算公式为:

式中：F为样品净荧光值，即样品孔荧光值减去空白板的荧光值；V为醋酸钠缓冲液的体积 (mL)，即250 mL；E为标准物质的荧光值；N为微孔板中标准物质的量(nmol)，即0.50 nmol；Vb为每个微孔板土壤悬浮液的体积 (mL)，即0.20 mL。

平均重量直径(MWD)计算公式为[19]

1.4 数据处理

对数据进行正态性检验，采用Origin 绘图，采用SPSS 25.0 进行双因素方差分析 (P＜0.05)，并用LSD 多重比较检验方法进行均值比较。

2 结果与分析

2.1 施肥对土壤物理化学及生物学性质的影响

表1 显示，长期施用有机肥(M 和NPKM 处理)相较于CK 和NPK 处理显著提高了土壤pH。与CK处理相比，NPK 处理的SOC 含量显著降低了3.4 g/kg，M 处理和NPKM 处理的SOC 含量分别显著提高了38.9%和32.0%。NPKM 处理的全氮含量和全磷含量分别显著提高32.0%和96.0%，对于EOC 含量, 长期施用有机肥(M 和NPKM 处理)显著高于CK 和NPK处理，NPK 处理相对于CK 处理显著提高了49.2%。与NPK 处理相比，NPKM 处理显著降低了＜0.053 mm团聚体含量，增加了0.053～0.25 mm 团聚体含量，不施肥处理(CK) 和长期施用有机肥(M 和NPKM处理)显著提高了土壤平均重量直径20.2%～26.6%。

表1 土壤基本理化性状Table 1 Basic physical and chemical properties of soil

从图1 可以看出，CK 与NPK 处理MBC、MBN和qSMBC 含量无显著差异，M 和NPKM 处理的MBC 和MBN 含量均显著高于CK 和NPK 处理，分别提高了1.62～2.32 和2.04～3.17 倍，NPKM 的MBN 含量也显著高于M 处理。相对于CK 和NPK处理的qSMBC 含量，M 处理提高不显著，NPK 处理提高显著。相对于CK、NPK 和M 处理，NPKM处理的BG、CBH、NAG、LAP 和AP 活性分别显著提高了319%～712%、423%～2061%、224%～598%、330%～523%和401%～549%，CK、NPK和M 处理间的CBH、NAG、LAP 和AP 活性无明显差异。

图1 不同施肥处理土壤生物学性质Fig.1 Soil biological properties as affected by fertilization modes

2.2 施肥和温度模式对土壤有机碳矿化的影响

在32 天培养期间，各处理在恒温和变温模式下的土壤有机碳矿化速率呈现相同的变化规律，在培养0—10 天快速下降，之后趋于平稳(图2)。CK 和NPK 处理变温培养条件下SOC 矿化速率始终高于恒温培养(图2)。有机肥处理 (M 和NPKM) 恒温和变温条件下SOC 矿化速率没有显著差异。施肥和温度均对CO2累积排放量产生显著影响，但二者不存在交互作用(图3)。恒温培养条件下，CK、NPK、M和NPKM 处理SOC 累积矿化量分别为 201、175、262 和228 mg/kg，相较于CK 的SOC 累积矿化量，M 和NPKM 处理显著增加了30.6% 和13.3%，而NPK 处理显著降低了12.7%。变温培养条件下，M 处理SOC 累积矿化量较CK 显著增加了30.0%，NPK 和NPKM 处理间以及与CK 相比均无显著差异(图3)。与恒温培养相比，变温培养下CK 和NPK 处理SOC 累积矿化量分别增加16.2% 和25.6%，而M 和NPKM 处理在恒温和变温培养下的CO2累积排放量差异不显著 (图3)。

图2 不同施肥处理土壤有机碳矿化速率Fig.2 Soil organic carbon mineralization rates under different fertilization modes

图3 不同施肥处理的土壤有机碳累积矿化量Fig.3 Cumulative soil organic carbon mineralization under different fertilization modes

2.3 土壤有机碳矿化的影响因素分析

相关分析结果(图4)表明，恒温培养下土壤CO2累积排放量与化学性质(土壤有机碳、全氮、速效氮、速效磷、C : N、易氧化态有机碳)和微生物性质(MBC、MBN、qSMBC) 存在显著的正相关，在变温培养条件下，CO2累积排放量与土壤化学性质显著正相关。变温相对于恒温模式下CO2累积排放量的变化率(ΔCO2)与土壤微生物性质和酶 (BG、CBH、NAG、LAP 和AP) 活性显著负相关。

图4 恒温和变温模式下CO2 累积排放量及其变化率与土壤化学性状、生物学性状间的相关性Fig.4 Correlation between cumulative CO2 emission and soil chemical and biological properties under constant and variable temperature conditions

恒温和变温培养下的CO2累积排放量均与土壤pH、有机碳、全氮和C : N 呈现显著线性正相关关系(图5)，恒温培养的CO2累积排放量也与MBC、MBN 显著正相关。ΔCO2与MBC、MBN、qSMBC、BG、CBH、NAG、LAP 和AP 呈显著负相关关系(图6)。

图5 恒温和变温模式下CO2 累积排放与主要土壤化学及生物学性质的关系Fig.5 Relationship between cumulative CO2 emissions and main soil chemical and biological properties under constant and variable temperature conditions

图6 CO2 累积排放量变化率(ΔCO2)与土壤生物学性质的关系Fig.6 Relationship between the change rate of cumulative CO2 emission (ΔCO2) and soil biological properties

3 讨论

3.1 施肥对土壤有机碳矿化的影响

土壤有机碳矿化是陆地生态系统碳循环的重要组成部分，施肥作为主要的农田管理措施，其通过改变土壤物理化学及生物学性质来影响土壤有机碳矿化过程[20]。本研究结果表明，与不施肥处理相比，长期施用化肥 (NPK)使SOC 含量降低了15.0%，这与吴萌等[21]和苗淑杰等[6]研究结果相反，但与郭振等[22]、乔云发等[23]和李渝等[24]的研究结果相一致，这可能是因为长期施用化肥不利于土壤大团聚体的形成，使得团聚体对有机碳的物理保护能力降低[6]。本研究也发现NPK 处理的团聚体平均重量直径显著低于CK 处理(表1)，证实了长期施用化肥降低了土壤团聚体稳定性。NPK 处理EOC 含量较高，进一步证实了该部分碳不稳定，容易矿化损失，使得该处理有机碳含量降低[25]。本研究中，长期施用有机肥处理的SOC 矿化速率和累积矿化量显著高于CK 和NPK处理，这与郭振等[22]、刘金炜等[14]研究结果一致。一方面，施用有机肥增加了SOC 含量和氮磷等养分有效性，为土壤微生物呼吸提供了充足的底物和营养物质[22,26]；另一方面，有机肥的施用提高了土壤pH(7.04～7.25)，缓解了土壤酸化，促进了微生物活性和生长繁殖[27]。且施加有机肥处理的MBC、MBN 含量显著高于不施有机肥处理，这与恒温短期培养下MBC、MBN 含量增加CO2累计矿化量随之增加的结果一致。李英臣等[28]研究了不同氮施入水平对湿地草甸沼泽SOC 矿化的影响，发现随培养时间的增加，有效碳源成为微生物活动的限制因素，土壤微生物活性降低，从而降低了SOC 的矿化速率，减少了SOC的累积矿化量。这与本试验中随着C/N 的增加CO2累积排放量随之增加的结果相一致。于冰等[29]基于祁阳红壤的研究发现，SOC 矿化与细菌和真菌种群丰度和多样性显著正相关，且土壤胞外酶活性与细菌丰度和真菌多样性也显著正相关，不同施肥处理间微生物种群多样性差异也可能是造成此结果的原因。

3.2 温度模式对土壤有机碳矿化的影响

在本研究整个培养时期(短期)内，变温模式与恒温模式的积温相同，CK 和NPK 处理在变温培养下SOC 累积矿化量显著高于恒温模式 (P＜0.01)，说明温度模式是影响SOC 矿化过程的重要因素。本研究结果也表明，在恒温模式下研究SOC 矿化特征可能会低估自然条件下的SOC 矿化潜势。因此，阐明不同温度模式对SOC 矿化的影响，对准确评估自然条件下SOC 周转过程具有重要意义。M 和NPKM处理在恒温和变温模式下的SOC 累积矿化量无显著差异，说明施用有机肥有助于调控温度周期性变化对SOC 矿化的影响。也有研究表明温度模式的变化显著影响SOC 矿化[30-31]，本试验中CO2在两种温度模式下变化率与土壤中MBC 含量呈负相关关系，即随着MBC 含量的增加，ΔCO2逐渐降低，究其原因可能是，施用有机肥增加了土壤中可供微生物利用的碳源和营养元素，提高了土壤中MBC 含量和MBN 含量[7]，促进了微生物的生长繁殖，且M 和NPKM 处理土壤中可用于矿化的活性有机碳的含量较多，其土壤微生物分解SOC 的速率要高于其他处理，使得温度对施用有机肥处理的碳矿化的影响较小。同时两种温度模式下由于微生物群落结构可能存在不同或微生物的活性有一定的差异，pH 在微生物的生长繁殖中起到了调节作用，施用有机肥处理的pH 显著提高，趋于中性，同时最适温度与恒定温度相同的微生物会被选择出来，形成恒定温度下特定具有优势的群落结构[31]，相比之下，变温模式中，因为日温度变化范围内存在许多种群的最适温度，因此可能会形成多样化的微生物群落共存[32]，从而导致变温模式下物种的多样化群落。施用有机肥处理的微生物群落适应性强，能够抵御温度周期性变化的干扰，降低了温度变化对有机碳矿化的影响，在本研究中，不同土壤化学性质与恒温和变温模式下CO2累积排放量显著相关，这可能由于温度变化使土壤的一些性质(比如微生物、pH、土壤结构等)发生改变[14,33]，从而使土壤中的有机碳更易被分解，但施有机肥处理在增加SOC 含量的同时也促进团聚体结构的形成，而颗粒有机碳受到团聚体的包裹作用从而避免被微生物降解[34]，两因素共同作用下，导致施有机肥处理降低了温度变化对SOC 矿化的影响。

4 结论

有机碳累积矿化量在恒温和变温条件下，均与土壤pH、有机碳和全氮含量正相关，只在恒温条件下与微生物生物量碳氮含量呈正相关。长期单施有机肥以及有机无机肥配施提高了黄壤pH 和SOC 含量，同时也提高了微生物生物量和酶活性，土壤SOC 累积矿化量在恒温或者变温条件下无显著差异，但均显著高于单施化肥土壤。长期不施肥或者单施化肥土壤在变温条件下的有机碳累积矿化量显著高于恒温条件下，说明施用有机肥缓解了温度周期性变化对SOC 矿化的促进作用。