淡水鱼中16种喹诺酮类抗生素UPLC-MS/MS检测方法的建立及膳食风险评价

高云慨 陈春泉 陈小妹 周凌聿 邓英林 尹青春

(海南省食品检验检测中心国家市场监管重点实验室〔热带果蔬质量与安全〕,海南 海口 570100)

近年来中国水产品的消费量保持稳定增长,其中水产养殖是水产品供应的主要途径[1]。随着规模化和集约化养殖方式快速发展,应激源和免疫力下降导致病害问题日趋严重[2]。

喹诺酮类抗生素(quinolones,QNs)作为一类新型合成抗菌药,被广泛应用于水产养殖业细菌性疾病的预防和治疗[3-4]。不同于其他抗菌药,QNs通过抑制DNA的复制来发挥抑菌作用,具有高效、广谱等优点[5-6]。以往监测数据[7-9]表明,多个地区均有养殖过程中QNs滥用的情况。QNs的大剂量、长时间使用,不仅会导致食物链富集超标而损害人体中枢神经系统和肝肾器官[10-11],也会产生细菌耐药性问题[12]。为保障消费者健康,中国政府、世界卫生组织、欧盟、美国、日本等均制定了相关的QNs残留限量标准,其检测项目也存在差异[13-15]。

目前用于QNs检测的主要方法有高效液相色谱法[16]、荧光分析法[17]、液相色谱串联质谱法[18-20]。高效液相色谱法特异性强、定量准确,但灵敏度低、检出限难以满足限量要求;荧光分析法灵敏度较高、操作简单、响应时间短,但稳定性和抗干扰性较差,对复杂食品基质有局限性;液相色谱串联质谱法具有灵敏度高、检出限低、分析速度快,分离和鉴定同时进行等优点,被广泛用于痕量分析,但基质效应会影响检测结果的准确性。高温烹饪是人们制作熟制品最主要的方式,相关研究主要集中在食品营养成分和风味物质含量变化上[21-22]。其中,涉及水产品中QNs残留量变化方面的研究和报道较少。研究拟采用三重四极杆—质谱结合同位素内标法建立一种前处理简便快速、分析时间短、灵敏度高,可同时测定淡水鱼及制品基质中16种QNs的检测方法。在此基础上,进一步分析3种高温烹饪方式对鱼肉中QNs残留量的影响,旨在为水产品及制品中喹诺酮类抗生素的监测和膳食风险评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

16种喹诺酮混标、恩诺沙星-D5内标:美国 A ChemTek 公司;

环丙沙星-D8内标:德国 Dr. Ehrenstorfer 公司;

诺氟沙星-D5内标:北京曼哈格生物科技有限公司;

甲酸、乙腈、甲醇、乙酸铵:色谱纯,德国 Merck 公司;

淡水鱼样品:市售。

1.1.2 仪器与设备

质谱仪:AB 4500型,美国SCTEX公司;

超声波清洗机:SK 7200型,上海科导超声仪器有限公司;

氮吹仪:XcelVap-XCV 5400型,美国Horizon公司;

低温冷冻离心机:5804R型,德国Eppendorf公司;

净化柱:Bond Elut C18型,500 mg,633 mL,美国Agilent公司;

Waters Oasis®PRime HLB固相萃取柱:200 mg,6 mL,美国Waters公司;

AgelaTechnologies Cleanert®MAS-Q固相萃取柱:美国AgelaTechnologies公司;

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18,1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美国Waters公司;

CORTECS T3:2.7 μm,2.1 mm×100 mm,美国Waters公司;

EclipsePlus RRHD C18:1.8 μm,2.1 mm×100 mm,美国Agilent公司;

Kinetex C8100A:1.7 μm,2.1 mm×100 mm,美国Phenomenex公司。

1.2 方法

1.2.1 仪器条件

(1) 质谱条件:离子源为ESI源,正离子模式;反应监测(MRM)模式;电喷雾电压5 500 V;离子源温度550 ℃;雾化气0.34 MPa;加热气0.34 MPa;气帘气0.17 MPa;碰撞室入口电压10 V。

(2) 色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm);柱温35 ℃;进样量5.0 μL;流速0.3 mL/min;流动相A为0.1%甲酸水溶液;流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0～2 min,5% B;2～3 min,5%～95% B;3～7 min,95% B;7～10 min,5% B。

1.2.2 样品前处理 称取5.0 g鱼肉均质样品至50 mL干净离心管中,分别加入质量浓度为10.0 μg/mL含3种混合内标标准溶液40 μL及10 mL乙腈(含4%甲酸),充分涡旋后超声10 min,10 000 r/min离心5 min;移取上清液5 mL至C18固相萃取柱进行净化,收集滤液过0.22 μm有机膜,上质谱测定。

1.2.3 标准溶液的配制

(1) 16种混合标准使用溶液(1.0 μg/mL):准确吸取100 μg/mL 16种喹诺酮混标100 μL,用2%甲酸乙腈定容至10 mL,于-18 ℃贮藏备用。

(2) 3种混合内标标准使用溶液(10.0 μg/mL):分别吸取1.0 mL质量浓度为100 μg/mL恩诺沙星-D5、环丙沙星-D8、诺氟沙星-D5,用2%甲酸乙腈定容,于-18 ℃贮藏备用。

1.2.4 基质标准曲线配制 选取空白基质阴性样品,按1.2.2的方法进行处理得到空白基质溶液,配制成质量浓度为2.0～50 ng/mL的基质标准工作曲线。

1.2.5 线性关系 采用建立的方法测定16种QNs空白基质标准工作溶液,以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标,进行线性回归计算,分别得到线性方程及相关系数。

1.2.6 检出限及定量限 通过测定16种QNs空白基质标准工作溶液,以3倍信噪比(S/N=3)时对应的目标物浓度计算得到方法检出限,以10倍信噪比(S/N=3)计算得到方法定量限。

1.2.7 回收率和精密度测定 选取阴性鱼肉样品,分别添加2,5,10 μg/kg 3个水平的16种QNs混标溶液,按照建立的方法进行测定,每个水平6次重复,分别计算回收率和精密度。

1.2.8 不同烹饪方式鱼肉中QNs残留量的测定 选取同一类型淡水鱼阴性样品搅拌均匀,分成2等份,一份作为阴性对照,另一份按一定比例向其中人工添加一定浓度16种QNs混标溶液,并采用均质器充分均质混匀,得到含量为200 ng/g阳性样品;阴性、阳性样品置于4 ℃冰箱12 h;将阴性样品和阳性样品分别分成4等份,并进行处理(每一组均有等量阴性样品作为空白对照):① 5.0 g鱼肉阳性样品无处理;② 5.0 g鱼肉阳性样品油炸3 min;③ 5.0 g鱼肉阳性样品水煮10 min;④ 5.0 g鱼肉阳性样品清蒸10 min。每组处理均按照建立的方法进行测定,每组4个平行样,重复2次。

1.2.9 数据处理 采用SPSS 22.0软件对数据进行处理,使用Origin 8.0软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

通过全扫描模式对16种QNs混合标准溶液及3种内标溶液进行正负离子扫描,得到一级全扫描图谱,19种化合物均在正离子模式下响应值最好。在正离子模式下继续进行二级质谱扫描,选定信噪比较高的特征离子分别作为定性和定量离子对,采用多反应监测模式优化电压和碰撞能。优化后的16种QNs及3种内标质谱参数见表1。

表1 16种QNs的质谱参数

2.2 色谱条件优化

2.2.1 色谱柱的选择 选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18、EclipsePlus RRHD C18、CORTECS T3、Kinetex C8100A 4种不同类型色谱柱进行分离效果评价。当使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、EclipsePlus RRHD C18时,19种化合物均能在5 min内实现分离,其中Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱峰型尖锐,响应值最好。黄季维等[22]采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱,能够有效分离出禽畜肉中18种QNs,其峰型均较好。因此,最终选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱作为分析色谱柱。

2.2.2 流动相的选择 对比了0.2%甲酸水/甲醇、水/甲醇、水/乙腈、0.2%甲酸水/乙腈、5 mmol/L乙酸铵水溶液/乙腈、5 mmol/L乙酸铵水溶液/甲醇6种不同流动相对16种QNs和3种内标物的分离效果。结果发现,当流动相含有甲酸时,分离效果较好,且采用0.2%甲酸水/乙腈流动相能够兼顾16种QNs及3种内标物,其色谱峰型对称、信号响应高、稳定性好。黄燕红等[23]发现采用UPLC-MS/MS法筛查豆芽中12种喹诺酮类药物残留时,选用0.1%甲酸水/乙腈作为流动相同样具有较高灵敏度,说明甲酸水/乙腈体系流动相适用于喹诺酮类抗生素的检测分离。因此,选用0.2%甲酸水/乙腈作为流动相。16种QNs化合物质谱总离子色谱图如图1所示。

图1 16种喹诺酮MRM色谱图

2.3 样品前处理方法优化

2.3.1 提取 试验采用乙腈作为提取溶剂,通过加标回收试验的方式,考察6种不同浓度甲酸/乙腈提取液(0,0.5%,1.0%,2.0%,4.0%,5.0%)对16种QNs提取效果的影响。由图2可知,纯乙腈和0.5%、1.0%甲酸/乙腈提取萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、奥比沙星的回收率偏高,说明以上3个浓度提取溶剂对这4个化合物显示基质增强效应;2%甲酸/乙腈提取时基质增强效应开始减弱;4%甲酸/乙腈作为提取溶液时整体回收率较好,回收率为88.0%～111.0%;当提取溶液中甲酸浓度达到5%时,部分化合物回收率偏高。因此,选择最优的提取液为4%甲酸/乙腈。

图2 样品提取液对16种QNs回收率的影响

2.3.2 净化 以回收率为指标,比对了C18、PRime HLB、MAS-Q 3种类型固相萃取柱的净化效果,结果如图3所示。Bond Elut C18、PRime HLB固相萃取柱对16种QNs均有回收,其中Bond Elut C18固相萃取柱的净化效果最佳,整体回收率为99.7%～117.8%;PRime HLB固相萃取柱对萘啶酸、恶喹酸、奥比沙星的回收率偏高;MAS-Q固相萃取柱的净化效果不理想,多数目标物无回收率,可能是柱填料对这些化合物具有吸附作用,未收集到目标物。因此,选择最优的固相萃取柱为Bond Elut C18。

图3 3种固相萃取柱对16种QNs回收率的影响

2.4 线性范围、检出限及定量限

采用优化好的方法对16种QNs空白基质标准工作溶液进行测定,其线性方程、检出限及定量限结果见表2。由表2可知,在2.0～50 ng/mL浓度范围内,16种QNs均呈良好线性关系,相关系数>0.998 49,检出限和定量限分别为0.3～4.1,0.9～11.0 μg/kg,优于SN/T 1751.2—2007中规定10.0 μg/kg的检出限值,说明试验方法灵敏度较高。

表2 16种QNs的线性关系、检出限、定量限

2.5 回收率与精密度

由表3可知,16种QNs的平均回收率为79.0%～104.7%,RSD为1.0%～8.1%,说明该方法的回收率及重复性较好,符合GB/T 27404—2008的要求。

表3 16种QNs的回收率和RSD

2.6 烹饪方式对鱼肉中QNs残留量的影响

为进一步分析高温烹饪对鱼肉QNs残留量的影响,根据饮食习惯采用油炸、水煮、清蒸3种日常烹饪方式对样品进行处理后测定QNs残留量,结果见图4。由图4可知,阴性样品均未检出,不作统计;3种烹饪方式的鱼肉阳性样品测定值与对照相比均无显著性差异,说明3种烹饪方式的鱼肉中喹诺酮类抗生素未发生明显降解,其热稳定性较好,对人体的膳食暴露仍存在较大威胁,因此,需要持续加强淡水鱼中喹诺酮类抗生素的监管及膳食暴露风险评估工作。薛哲等[24]研究表明,内酰胺类以及大环内酯类抗生素在高温下容易开环,而氨基糖苷类等抗生素的热稳定性较好,但有关喹诺酮类抗生素的降解尚未见报道。

图4 烹饪方式对鱼肉中QNs残留量的影响

3 结论

采用内标法建立了淡水鱼中16种喹诺酮类抗生素UPLC-MS/MS的检测方法,该方法前处理简单,具有良好灵敏度和重现性,适用于鲜活鱼类及不同高温烹饪处理后鱼肉样本的检测,各化合物均在5 min内完成分析,可满足淡水鱼中喹诺酮类抗生素的高通量筛查及膳食风险评价。对水煮、清蒸及油炸3种烹饪方式的鱼肉加标样品进行检测,发现3种烹饪方式测定值与对照相比,16种喹诺酮类抗生素残留量均无显著性差异,说明传统烹饪方式对鱼肉中喹诺酮类抗生素降解效果不明显。后续需要持续加强淡水鱼中喹诺酮类抗生素的监管及膳食暴露风险评估工作。