内源性因素对抗体夹心免疫法检测血清心肌肌钙蛋白I的干扰及解决方案研究进展

何成山，刘 洋，徐 正，蒋秀娣，陆志成(.上海中医药大学附属第七人民医院医学检验科，上海 0037；.上海中医药大学，上海 003）

心肌肌钙蛋白复合物由三个亚基组成，分别为心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）和心肌肌钙蛋白C（cardiac troponin C，cTnC），三种亚基通过非共价作用力结合在一起，在心肌细胞收缩过程中扮演重要角色[1]。cTnI 只在心肌细胞中表达，cTnI 单体形式半衰期短，以cTnI-cTnT-cTnC 结合物的形式存在。当心肌细胞受损时，cTnI 释放至外周血液循环中主要以cTnI-cTnC 的形式存在，游离的cTnI 浓度极低[2]。cTnI 检测的发展历程随着抗体夹心免疫技术的飞速发展，从最初的酶联免疫吸附定性实验，逐步达到cTnI 定量检测，到如今超敏cTnI 已全面覆盖临床实验室，cTnI 检测水平达到ng/ml，成为诊断心肌损伤的首选血清学标志物[3]。过去cTnI 的免疫检测经常受到溶血、黄疸、脂血、抗凝剂等分析前干扰因素的影响，随着免疫检测技术敏感度、特异度和准确度的不断提高，其干扰作用已微乎其微。近年来一些内源性因素即免疫性的自身抗体如心肌肌钙蛋白I 自身抗体（cardiac troponin I autoantibody，cTnIAAb）、异嗜性抗体（heterophile antibody，HA）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）等对cTnI 检测带来的严重干扰作用常见报道，本文就内源性因素对抗体夹心免疫检测血清cTnI 的干扰及解决方案研究进展作一综述。

1 抗体夹心免疫法检测cTnI

血清cTnI 定量检测方法较多，不同方法之间的检测性能可能存在较大差异，常见的cTnI 检测方法有酶联免疫吸附法、化学发光法、酶联荧光分析法、胶体金免疫层析法、免疫比浊法、飞行质谱和生物传感器法[4]。目前临床上超敏cTnI 多采用的是基于化学发光的抗体夹心免疫检测法，血清样本中cTnI 与cTnI 捕获抗体包被的介质混合，使得cTnI-捕获抗体结合并吸附在固相载体上，孵育冲洗后，将添加化学发光基团标记的cTnI-检测抗体加入至cTnI-cTnI 捕获抗体的固相载体上（检测抗体与捕获抗体应具有不同的cTnI 抗原结合位点），再次孵育冲洗后形成cTnI 捕获抗体-cTnI-cTnI 检测抗体的结合物，测量发光基团产生的化学发光反应，通过标准曲线计算cTnI 浓度。基于抗体夹心免疫法检测cTnI 的原理，检测和捕获抗体需要与cTnI 多肽链不同区段的抗原位点结合，因此cTnI与cTnI 抗体的结合位点的亲和性显得尤为重要，此外两个特异性抗体的匹配度对于cTnI 检测的准确度也会产生较大的影响，如何针对cTnI 选择亲和度强且不同结合位点的配对cTnI 单克隆抗体，为抗体免疫夹心法检测cTnI 的核心内容。海肽作为业界深耕cTnI 检测抗体领域的公司，科学家们经过长期对cTnI 单克隆抗体的研究，针对夹心发光免疫检测系统，提供了一些优化的不同抗体位点的配对结果见表1。这些配对的单克隆抗体本底低、灵敏度强、特异度和准确度好，目前已被大部分cTnI 检测厂商所认可。

表1 cTnI 抗体夹心免疫检测系统推荐配对抗体

由于人体血液中cTnI 的异质性以及不同试剂厂商所使用的抗体的特异性抗原表位不一致，导致了不同cTnI 检测试剂之间检测结果存在较大差异。周伶俐等[5]对临床实验室应用不同检测系统检测血清cTnI 结果一致性进行研究，结果显示四种常用的cTnI 检测系统（迈瑞CL-200i，万孚FS-205，Genein 1600，UniCel DxI 800）结果一致性较差，同一检测系统不同实验室检测结果间也存在一定的差异。在第一代cTnI 检测试剂中，不同试剂之间结果的差异可超过1 000 倍，近年来在国际各组织、临床检验工作者、科学家、试剂生产商的共同努力下，检测结果的一致性已经得到了显著改善，然而cTnI 检测的标准化至今仍未实现。基于国际临床化学和检验医学联合会公布的现阶段使用的国际知名cTnI 检测系统所使用的抗体特异性抗原表位见表2[6]。可见不同厂商的抗原识别位点存在部分差异，大部分特异性抗体的抗原表位主要集中在靠近中心稳定区域的氨基端a.a.r 20～30 及稳定区域a.a.r 31～50 和80～90。

表2 临床上常用cTnI 检测系统捕获/检测抗体抗原表位

2 cTnI 检测的内源性干扰因素

2.1 cTnIAAb 1996年BONHER 等[7]首次发现了一种可与cTnI 结合的IgG，后续的研究证实了该IgG 为cTnI 检测结果异常的主要负性干扰因素，并首次提出了心肌肌钙蛋白I 自身抗体cTnIAAb（cardiac troponin I autoantibody）[8]。 心肌损伤后cTnI 释放到外周循环中，血液中的cTnI 可作为始动抗原促进机体的自身免疫系统产生特异性cTnIAAb[9]。cTnIAAb 广泛存在于缺血性心肌病[10-11]、扩张性心肌病[12]等疾病中，可直接参与心肌损伤后心室重构的过程，诱导心肌细胞发生凋亡现象[13]。单体cTnI 氨基酸两端极易发生蛋白水解，其分子a.a.r 30～110 因受到内源性TnC 的保护为中心稳定区域[14]。目前大多数商业化cTnI 检测试剂盒中的特异性抗体均针对中心稳定区域设计抗原表位，在后续的临床检验工作中我们发现cTnI 免疫学检测依然会受到多种干扰，其中最主要的就是cTnIAAb[15]。吴豫等[16]采用五种临床常用的cTnI检测系统（Access-2，Architect i2000，Axsym，Dimension X Pand，Vidas），评估cTnIAAb 对cTnI检测的影响，结果显示cTnIAAb 对常用 cTnI 检测系统均出现一定程度的负性干扰，但不同检测系统之间干扰程度亦有差距；我们在前期研究[17]中将纯化的人源性cTnIAAb 加入一例cTnI 检测浓度为6.02ng/ml 血清样本，结果显示随着cTnIAAb 蛋白量加入量增多，cTnI 回收浓度逐渐降低，cTnI 下降率显著提升，当加入cTnIAAb 量达20μl 时，cTnI下降率高达62.06%。cTnIAAb 可与cTnI 检测试剂中的特异性抗体竞争结合cTnI 多肽链的中心稳定区域，导致特异性检测抗体无法捕捉多肽链上的抗原表位，造成cTnI 检测结果的假性降低，产生心肌损伤类疾病的临床诊断风险，以上研究均证实了cTnIAAb 对cTnI 检测的负性干扰是真实存在的。而对于不同cTnI 检测系统对同一份cTnIAAb 阳性样本产生了cTnI 检测结果不一致的现象，这是由于不同cTnI 检测系统中检测抗体和捕获抗体的靶标抗原位点存在差异，基于表2 中主流cTnI 检测系统的单克隆抗体结合位点，不难看出尽管大部分抗体位点位于中心稳定区域，但依旧存在较大差异，这就造成了不同cTnI 检测试剂的异质性。

cTnIAAb 作为一个人源性的自身抗体，相较于商业化重组制备的单克隆检测抗体，cTnIAAb 与cTnI 结合位点必然不会在cTnI 肽链的某一个固定区段，那么cTnIAAb 与cTnI 结合具体抗原位点究竟集中在cTnI 多肽链的哪些部位？后续的研究也是给出了答案。SAVUKOSKI 等[18]采用已知抗原位点的单克隆cTnI 抗体与cTnIAAb 竞争结合血清中cTnI，计算cTnI 回收率，评估cTnIAAb 与cTnI结合位点。结果显示加入a.a.r 65～74，83～93，86～90，104～119，117～126 和130～145单克隆cTnI 抗体位点，cTnI 平均回收率均小于50%，这些片段主要位于cTnI 肽链的中心稳定区域并向羧基端延伸，其中受自身抗体严重影响的中心稳定区域与大部分商业化cTnI 试剂盒的抗体结合位点相似，这也证实了大部分cTnI 抗原位点都无法摆脱cTnIAAb 干扰的原因。对于后续研发新型cTnI 检测试剂而言，我们的特异性抗体应有3 个及以上的抗原表位，以此来规避cTnIAAb 的负性干扰现象。

2.2 HA 异嗜性抗体（heterophile antiody,HA）是人类外周循环中的内源性抗体，其本质是一种多重、多特异性的免疫球蛋白，可与多个物种的免疫球蛋白发生弱结合的非特异性反应，因而该抗体可以干扰免疫测定[19]。HA 在人群中的发生率约为0.1%～3%，与接触家养和野生动物、输血、自身免疫性疾病、血液透析等相关[20]。HA 中典型的有人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）、人抗兔抗体、人抗羊抗体等，其中接受过小鼠单克隆抗体制剂诊疗的患者，其血液样本中可能含有高浓度的HAMA[21-22]。对于临床免疫学检测而言，影响最大的莫过于HAMA，因为大多数免疫学检测的诊断试剂均采用鼠单抗。cTnI 的免疫学检测中，HAMA 若替代待检抗原与检测抗体和捕获抗体相结合，会出现cTnI 检测结果假性升高；HAMA 若分别于检测抗体和捕获抗体相结合，则会出现cTnI 检测结果假性降低，而临床检验工作中HAMA 主要造成cTnI 检测结果假阳性[23]。GRAÇA SANTOS 等[19]人报道了一例57 岁患者，主诉胸骨疼痛放射至左上肢，cTnI 水平稳定升高，在经过心电图和冠状动脉造影后并未发现梗阻和缺血性病变，后续出院后，再次因相同主诉入院，cTnI 水平达26.81ng/ml，经检查依旧未见心肌梗死的临床表征，推测该患者血液循环中存在干扰cTnI免疫检测的HA。NGUYEN 等[24]人也报道了一例有趣的cTnI 假性升高的临床案例，患者cTnI 水平升高，其心电图及急性心肌梗死（aucte myocardial infarction，AMI）血清学标志物均未发现异常，其血清样本更换Advia Centaur TnI-Ultra 检测系统进行cTnI 检测，结果显示阴性，研究人员将血清样本稀释两倍，cTnI 检测水平并未按比例下降，反而增加，推测这可能是HA 强干扰的表现。在大部分HA 干扰检测的血清中加入异嗜性抗体阻断剂后，cTnI 检测结果均可下降达80%以上，此外研究发现在HA 高度阳性的血清中，患者血红蛋白水平与cTnI 的浓度存在相关性，可作为HA 血清浓度的替代标记物[25]。目前各大cTnI 检测试剂厂商解决HA效应影响最有效的办法就是嵌合抗体或者完全人源化抗体，商业化检测抗体都采用嵌合抗体即将动物源抗体的恒定区替换为人源抗体，通过嵌合抗体可有效封闭大部分动物源性抗体造成的检测干扰。

2.3 RF 类风湿因子（radio frequenoy，RF）常存在于类风湿性关节炎、自身免疫性疾病、慢性炎症患者的血清及关节滑膜腔液中。RF 干扰免疫学检测的现象常见报道，其本质为一种变性的IgG 为靶抗原的自身抗体，该抗体能非特异性结合免疫球蛋白即检测抗体和酶标捕获抗体的Fc 段，容易造成抗体夹心免疫法检测cTnI 假阳性的现象[26]。陈超超等[27]人对10 例cTnI 检测结果异常升高与临床心肌损伤症状不符样本进行分析，发现10 例患者均具类风湿关节炎病史且RF 呈高滴度阳性，对样本进行稀释复测，cTnI 检测结果未成线性下降趋势，而加入RF 灭活剂2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）后，cTnI 转变为阴性，研究结果证实了RF可造成cTnI 检测结果的假阳性。

3 内源性干扰因素的鉴别诊断及解决方案

cTnIAAb，HA 和RF 等内源性因素可严重影响cTnI 检测结果的准确性，如何鉴别这种内源性的干扰，对检验和临床医生都提出了较大的挑战。当日常检验工作中出现cTnI 检测结果与其他心肌损伤血清标志物：肌红蛋白、肌酸激酶及肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶等检测结果严重不符时，我们应当警惕是存在内源性自身抗体干扰cTnI 检测现象的存在，并向临床医生询问病人的临床表征和心脏影像学检查是否与cTnI 检测结果一致，共同探讨分析造成cTnI 检测结果异常的原因。当怀疑cTnI 检测过程中存在内源性自身抗体干扰现象时，可以采用以下方法进行鉴别：①不同cTnI 检测系统的检测抗体和捕获抗体抗原识别位点不同，自身抗体可以干扰一种或几种cTnI 检测系统，但不一定会干扰所有的cTnI 检测系统，我们可以采用不同的cTnI 检测试剂进行复检；②对于内源性自身抗体造成的cTnI 假阳性检测样本我们采用阴性血清样本进行倍比稀释，当样本未受到自身抗体干扰时，cTnI 检测结果应呈线性下降，若稀释后检测结果无良好的线性关系，则表明可能受到HA和RF 的干扰；③对干扰检测的内源性自身抗体进行预处理：对于cTnIAAb 可以通过蛋白G 琼脂糖凝胶4FF 过滤，抗体纯化树脂可有效结合多种IgG种类和亚类，消除人源性IgG cTnIAAb 的负性干扰[14]；HA 加入异嗜性抗体阻断剂-1，该型具有特异性鼠免疫球蛋白[28]，因大部分cTnI 特异性检测抗体均为鼠源性单克隆抗体，所以具有较好的阻断特效；RF 可加入2-Me 直接破坏IgG 和IgM 的二硫键达到消除RF 的影响[28]；④直接检测样本中的内源性自身抗体：cTnIAAb 目前尚无商业化的检测试剂盒，大多数文献的报道均采用酶联免疫吸附试验的检测方法[29]和cTnI 相关抗原的回收实验[2]，在我们的前期研究中新建立了一种基于蛋白芯片的化学发光免疫分析法，可机器化操作定量检测cTnIAAb[30]，异嗜性抗体目前有HAMA检测试剂盒，可直接检测抗小鼠HAMA 抗体，RF 和抗核抗体谱大多数实验室可直接定量检测。

4 总结与展望

综上所述，基于临床上常用的cTnI 抗体夹心免疫检测原理，cTnI 与不同cTnI 抗原表位单克隆抗体的亲和度及夹心抗体的适配度，对于cTnI 检测的灵敏度和特异度至关重要。目前临床上常用的cTnI 检测系统中cTnI 捕获和检测抗体的抗原识别位点不一致，造成了cTnI 检测结果的一致性仍然存在一定的差异。在cTnI 临床检测中，内源性的自身抗体可严重干扰cTnI 检测结果，影响临床上对心肌损伤类疾病的诊断、治疗及预后。其中cTnIAAb 可造成cTnI 检测结果假阴性，HA 和RF则会导致cTnI 检测结果假阳性，在临床检验工作中出现心肌损伤类标志物检测结果不一致时，首先检查室内质控及仪器运行状态，复检确认检验结果无误后，检验医生应及时与临床医生沟通了解病人的临床表征及超声影像学检查结果，共同分析探讨造成cTnI 检测结果异常的原因，以免贻误病情的诊断和治疗。