基于环境DNA宏条形码的汉江上游黄金峡段鱼类多样性研究

丁洋 李艳艳 赵进勇,† 彭文启 张晶 任锦豪

北京大学学报(自然科学版) 第60卷 第1期 2024年1月

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 1 (Jan. 2024)

10.13209/j.0479-8023.2023.080

中国水科院“城乡水系生态景观构建理论和技术研究创新团队”项目(WE0145B042021)和水利部重大科技项目(SKR-2022052)资助

2022–12–07;

2023–06–19

基于环境DNA宏条形码的汉江上游黄金峡段鱼类多样性研究

丁洋1,2李艳艳3赵进勇1,2,†彭文启1,2张晶1,2任锦豪1

1.中国水利水电科学研究院, 北京 100038; 2.水利部京津冀水安全保障重点实验室, 北京 100038; 3.北京大学地球与空间科学学院, 北京 100871; †通信作者, E-mail: zhaojy@iwhr.com

2020 年, 采用环境 DNA 宏条形码对汉江上游黄金峡鱼类多样性进行研究, 并对比历史调查数据, 构建汉江上游黄金峡段鱼类名录。从 9 个采样点中共检测出 20 种鱼类, 占名录的 45.45%; 鲤鱼()、鲫鱼()、圆吻鲴()和银鮈()为优势种; 黄金峡上、下游 Shannon 指数存在显著性差异(<0.01,=9), 上游鱼类 Shannon 指数明显大于下游, 黄金峡水利枢纽是造成鱼类多样性空间差异的主要原因。环境 DNA 检测出的鱼类组成与过去传统方法监测的结果相近。环境 DNA 宏条形码技术是一种新兴的生物监测手段, 可以辅助传统鱼类监测方法, 快速检测汉江上游鱼类多样性及其空间分布。

环境 DNA 宏条形码; 鱼类多样性; 汉江上游黄金峡段

河流、湖泊和湿地是地球上生物多样性最丰富的地方之一, 它们以仅占地球表面 1%的面积, 贡献了全球 50%的鱼类多样性[1]。鱼类多样性是生物多样性的重要组成部分, 保护鱼类多样性有利于维持水生态系统的稳定与健康。但是, 目前针对鱼类多样性的研究缺乏足够的调查工作[2]。2021 年, 世界自然基金会(WWF)和世界自然保护联盟(IUCN)等 16 个组织联合发布的报告指出, 已知有 80 种淡水鱼类灭绝, 其中仅 2020 年就灭绝 16 种, 1970 年以来, 淡水洄游鱼类的数量下降 76%, 大型淡水鱼类的数量下降 94%[3]。取水、引水以及农业扩张和集约化等人类活动是对淡水供应量和质量的主要威胁因素, 而生境破碎化和流量变化通过改变河流和洪泛区湖泊等, 成为对淡水生物多样性的主要威 胁[4–5]。在淡水鱼类多样性丧失日益严重的背景下, 掌握鱼类多样性现状变得尤为重要[6]。

传统的鱼类调查方法(拖网、围网、电捕鱼、钓鱼、水声和视觉等)耗时费力, 价格昂贵, 可能对鱼体造成伤害, 并对调查人员具有较高的分类学知识要求[7]。目前, 基于环境 DNA 宏条形码(environ-mental DNA metabarcoding, eDNA metabarcoding)技术的物种检测彻底改变了生物多样性调查的方式, 被证明是一种高效、经济和非侵入性的生物监测方法[8]。环境 DNA 宏条形码技术通过直接从环境样本(例如沉积物、粪便、水、土壤或空气)中提取DNA, 利用识别鱼类种群的通用引物进行 PCR 扩增和高通量测序, 确定鱼类的种类和相对丰度, 并计算不同区域的鱼类多样性[9–10]。监测过程无需采集目标生物, 极大地简化了鱼类检测步骤, 弥补了传统形态学监测的不足[11]。环境 DNA 宏条形码在鱼类物种多样性分析、外来入侵鱼类物种足迹追踪和濒危珍稀鱼类资源调查中表现出明显的优势和巨大的潜能。Sales 等[7]利用环境 DNA 宏条形码, 监测和分析巴西热基蒂尼奥尼亚河流域鱼类群落的时空动态。Robson 等[12]利用环境 DNA 宏条形码检测热带入侵鱼类物种。Song 等[13]利用环境 DNA 宏条形码, 定量地计算水流特征对亚洲鲤鱼入侵检测概率的影响。国内利用环境 DNA 宏条形码开展鱼类多样性调查的研究目前较少, 但也针对鱼类资源、物种多样性及濒危珍稀鱼类资源调查开展了一些研究。Wang 等[14]利用环境 DNA 宏条形码评价我国东海大黄鱼资源。舒璐等[15]基于环境 DNA 宏条形码研究洱海鱼类多样性。吴昀晟等[16]对比环境 DNA宏条形码与传统调查法对长江江豚的检测结果, 证明环境 DNA 宏条形码在长江江豚监测中不仅具有较高的准确性, 还具有更高的灵敏性。

汉江是长江最大的支流, 上游紧依中国南北分界线(秦岭–淮河线)的南界, 是重要的水源涵养生态功能保护区, 也是中国南水北调中线工程和引汉济渭工程的水源地[17–20]。典型的山地生态系统决定了汉江上游生态环境的敏感性和脆弱性, 极易受到人为干扰和气候变化的影响[21]。目前针对汉江鱼类的调查研究多集中在中下游地区[22–24], 对汉江上游鱼类多样性的调查研究鲜有报道。随着长江流域重点水域“十年禁渔”措施的全面启动[25], 汉江作为禁捕水域之一, 传统的鱼类调查方法不再适用于该区域。

基于上述背景, 本研究首次利用环境 DNA 宏条形码, 对汉江上游黄金峡段鱼类多样性的空间分布特征进行调查分析, 旨在探讨环境 DNA 宏条形码技术在检测汉江上游鱼类多样性可行性, 为汉江上游鱼类多样性监测及生物资源估算提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 生物监测点位选择

汉江发源于陕西省宁强县, 自西向东流经陕西省内汉中、安康两市, 并于安康市白河县流出陕西省。汉江上游流域位于亚热带季风气候区, 年均气温为 13.2℃, 多年平均降雨量为 895mm[26]。本次调查区域位于引汉济渭水源地——黄金峡水利枢纽上游及下游, 涉及汉中市洋县和西乡县。于 2020 年11 月 13 日至 16 日进行采样, 分别选取 9 个采样点, 样点编号及位置见图 1。其中, 在黄金峡水利枢纽坝上布设 5 个采样点(S1～S5), 坝下布设 4 个采样点(S6～S9); 汉江干流全长约 100km, 设置 6 个样点, 汉江支流党水河、金水河及子午河各设一个样点。

1.2 环境DNA样品采集及环境DNA测定

使用 2.5L 的采水器, 在每个样点采集表层水和底层水各 1L, 混合后保存至已消毒的 2L 广口瓶中。所有样品均在 24 小时内使用 0.45μm 的混合纤维素滤膜(MCE; Whatman公司)进行真空抽滤, 玻璃抽滤漏斗在每次抽滤前用 10%的次氯酸钠消毒液浸泡30 分钟, 并用纯净水冲洗干净, 防止样品间的交叉污染。为评估是否存在外源 DNA 污染, 每次过滤设置一个阴性对照。样品过滤后, 富集环境DNA 的滤膜分别装入 5mL 的离心管中, 于−20℃保存, 并尽快送往实验室进行 DNA 提取。滤膜送往上海美吉生物医药科技有限公司进行环境 DNA测定、PCR 扩增及高通量测序。

1.3 历史数据调查

通过对照洋县水利局鱼类资源数据, 整理得到汉江上游黄金峡段鱼类名录。

2 结果与分析

2.1 物种组成

通过环境 DNA 宏条形码检测, 从 9 个采样点的样品中共得到有效拼接序列 542400 条, 注释出鱼类20 种, 隶属 3 目 7 科 18 属(表 1)。各采样点鱼类物种及其相对序列丰度见图 2, 采样点与鱼类物种关系如图 3 所示。各采样点的鱼类物种组成存在明显的差异, 其中鲤科(如鲫鱼、鲤鱼和花鱼骨)在各采样点均显示出相对较高的序列丰度。

2.2 历史调查数据

通过收集洋县水利局鱼类资源数据, 统计得到鱼类 37 种, 属于 4 目 7 科 30 属。其中, 鲤形目物种数最多, 有 30 种, 占比为 81.08%; 其次是鲈形目, 有 5 种, 占比为 13.51%; 鲇形目有两种, 占比为5.41%; 鲶形目有一种, 占比为 2.70%。结合环境DNA 宏条码的检测结果, 最终统计得到鱼类 44 种, 属于 4 目 8 科, 整理得到汉江上游黄金峡段鱼类名录, 见附录(访问 http://xbna.pku.edu.cn 查看附录)。

从图 4 可以看出, 由历史调查数据和环境 DNA宏条形码共同检测出的鱼类共 13 种, 占总种数的29.55%; 仅由历史调查数据统计得到的鱼类共 24种, 占总种数的 54.54%; 仅由环境 DNA 宏条形码检测出的鱼类共 7 种, 占总种数的 15.91%。

仅由环境 DNA 宏条形码检测出的鱼类为激流马口鱲(_sp._ZF-11309)、福建小鳔鮈(_)、红尾副鳅(_)、圆尾拟鲿(_)、大鳍鳠(_)、神农吻虾虎鱼(-)和真吻鰕虎鱼(_)。

2.3 物种空间分布

根据研究区位置, 将采样点分为黄金峡水利枢纽上游区域和下游区域(简称黄金峡上游、黄金峡下游)。t 检验方法显示(图 5), 黄金峡上下游 Shannon指数存在显著性差异(<0.01,=9), 黄金峡上游鱼类 Shannon 指数明显大于下游。基于采样点中鱼类物种序列丰度数据, 利用 Wilcoxon 秩和检验方法, 检验黄金峡水利枢纽上下游鱼类物种差异的显著性。由图 6 可以看出, 黄金峡上游及下游鱼类物种差异明显。黄金峡下游鱼类监测物种均为鲤科, 以圆吻鲴(41.56%)、鲤鱼(32.65%)和银鮈(25%)为主; 黄金峡上游鱼类监测物种以鲫鱼(34.32%)、鲤鱼(13.92%)和波氏吻鰕虎鱼(11.09%)为主, 且鲇鱼、断线麦穗鱼、激流马口鱲、马口鱼、花鱼骨、细纹颌须鮈和红尾副鳅等鱼类物种均有涉及。

图2 各采样点鱼类物种相对序列丰度

图3 各采样点与鱼类物种关系Circos图

表1 汉江上游黄金峡段9个采样点环境DNA宏条形码注释鱼类物种

灰色区域代表本研究环境 DNA 宏条码所检测物种, 白色区域代表历史调查数据

图5 黄金峡上下游 Shannon 指数组间差异

图6 各采样点鱼类物种空间差异

3 讨论

3.1 基于环境DNA宏条形码的汉江上游黄金峡段鱼类多样性检测

本研究运用环境 DNA 宏条形码技术分析汉江上游黄金峡段鱼类多样性, 共检测出 20 种鱼类, 鱼类物种以鲤科居多, 共 12 种, 占鱼类物种总数的 60%, 其中鲤鱼、鲫鱼、圆吻鲴和银鮈为优势种。对比汉江上游黄金峡段鱼类名录, 在 9 个采样点位利用环境 DNA 宏条码检测出 20 种鱼类, 占名录的 45.45%, 表明环境 DNA 宏条码具有较高的准确率。此外, 有 7 种鱼类未出现在历史统计数据中, 如激流马口鱲(spZF-11309)、福建小鳔鮈()和红尾副鳅()等小型鱼类。可能是由于汉江上游黄金峡段鱼类调查数据十分稀少, 导致本研究鱼类目录收集不完整, 因此部分检测物种未出现在历史调查数据中。环境 DNA 宏条形码技术能克服传统调查方法的一些局限性, 对传统捕捞方法进行补充观测, 从而减少传统调查方法观测不到位导致的生物多样性下降情况。

1980—1982 年, 陕西省动物研究所等机构的研究人员在石泉大坝以上干支流共采集到 61 种鱼类, 种类组成同样以鲤科鱼类为主, 占物种总数的63.93%[27]。王晓臣[28]在 2010—2012 年开展整个汉江陕西段的鱼类调查, 在石泉大坝以上干支流共采集 63 种鱼类, 种类组成以鲤科鱼类为主, 占物种总数的 64.52%, 以棒花鱼、麦穗鱼、宽鳍眠、马口鱼及鲇鱼为优势物种。采样点涉及的河段为历史调查河段的一部分, 可能是本研究检测出的鱼类种数不如传统渔获物方法监测的鱼类种数多的主要原因, 但检测出的鱼类组成与过去传统方法监测的结果相近, 并均显示鱼类以鲤科为主, 占物种总数的 60%左右。尽管低丰度鱼类物种的 DNA 难以采集, 但可以通过增加采样点和采样次数等方式, 提高检测率[29]。

3.2 汉江上游黄金峡段鱼类空间分布分析

黄金峡下游检测的鱼类物种仅有鲤科, 其中圆吻鲴、鲤鱼和银鮈等静水性鱼类为优势物种。现场调研发现, 黄金峡下游取样点为石门水库库区回水区, 属静水区域, 水面宽, 流速小且稳定, 水位较高, 水流对河岸坡栖息地的冲蚀能力较弱。受水库回水的影响, 原有的河道失去急流、浅滩和较大的蜿蜒度[30], 破坏了喜急流性鱼类的栖息环境, 因而黄金峡下游中急流性鱼类数目减少, 静水性鱼类数目相应地增加, 以圆吻鲴、鲤鱼和银鮈为主的静水鱼类在黄金峡下游区域占主导地位, 鱼类多样性较低。黄金峡上游检测鱼类物种包括鲤科、鳅科、鲿科、鲇科、鳢科和鰕虎鱼科, 涵盖所有检测出的鱼类科目, 鱼类多样性高。其中, S1 和 S5 采样点分别位于汉江支流党水河和金水河, 为山区溪流河道, 受地势起伏及河流蜿蜒等因素影响, 水流流态多样, 生境复杂多样, 底质条件显著差异, 地貌单元复杂多样[31], 因而这两处采样点检测出的鱼类多样性高, 且种类也包括急流性鱼类及静水性鱼类。黄金峡水利枢纽的建设及截流, 在很大程度上阻断了上下游的鱼类活动, 影响鱼类坝上与坝下的迁移交流, 同时大坝极大地影响鱼类的生存环境(改变栖息地的物理和生态特征, 如改变水流、营养动态、水质和温度)[32–34]。水利工程的建设是造成鱼类多样性及物种的差异的主要原因。

3.3 汉江上游环境下段环境DNA宏条形码技术对比原始调查方法的优劣性探讨

与传统的鱼类监测方法相比, 环境 DNA 宏条形码技术在鱼类物种鉴定及多样性评估等方面具有明显的优势。1)非破坏性采样: 少量的水样采集不会危害当地濒危鱼类, 也不会破坏当地生态环境; 2)无采样限制: 不受禁渔期和禁渔区的限制, 可以根据研究需求设置监测点位; 3)高效便捷, 节约成本。环境 DNA 宏条形码技术使用 2 L 左右的水样便可实现多个分类单元的快速鉴定, 可减少船只租赁或购买渔获物的费用, 无需依赖形态学和分类学的专业知识[35–36]。

在实际分析中, 需要考虑采样点上游环境 DNA输移的影响。受环境 DNA 输移的影响, 某个采样点的鱼类检测结果不一定意味着在采集时鱼类个体就在此处, 可能导致对采样点鱼类丰富度的高估。因此, 本研究位于河口的采样点(S1 和 S5)检测出的高鱼类多样性需要进一步验证。河口处受到支流上游来水和干流顶托来水的双重影响, 流速减缓, 泥沙沉积明显, 导致环境 DNA 可能存在于水体中, 也可能与表层沉积物结合, 同时受环境 DNA 的输移和积累影响, 较高浓度的环境 DNA 可能有助于沉积物中 DNA 分子的再悬浮, 从而影响在空间和时间尺度上鱼类物种及多样性的推断。然而, 由于在汉江上游水环境中还没有进行过有关环境 DNA 输移和扩散的研究, 很难就这一问题得出可靠的结论。因此, 开展环境 DNA 的时空动力学研究有助于更精确地使用环境 DNA 宏条形码技术来检测鱼类多样性。

4 结论

本研究首次使用环境 DNA 宏条形码技术评估汉江上游黄金峡段鱼类多样性, 证明了该技术监测汉江上游鱼类物种组成和鱼类空间分布情况的可行性。环境 DNA 方法可作为评估研究区鱼类多样性可靠的补充方法, 为渔业资源的调查和保护提供新的视角。本文结论如下: 1)通过环境 DNA 宏条形码技术和历史调查数据构建汉江上游黄金峡段鱼类名录, 环境 DNA 宏条形码技术检测出 20 种鱼类, 占名录的 45.45%, 鱼类物种以鲤科居多, 占鱼类物种总数的 60%, 其中鲤鱼、鲫鱼、圆吻鲴和银鮈为优势种; 2)与黄金峡下游相比, 黄金峡上游鱼类多样性较高, 黄金峡水利枢纽是造成鱼类多样性空间差异的主要原因; 3)在今后鱼类监测过程中, 应开展环境 DNA 的时空动力学研究, 可减少环境 DNA 宏条形码技术检测的不确定性。

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Investigating Fish Diversity in Huangjinxia Section of the Upper Hanjiang River Based on Environmental DNA Metabarcoding

DING Yang1,2, LI Yanyan3, ZHAO Jinyong1,2,†, PENG Wenqi1,2, ZHANG Jing1,2, REN Jinhao1

1. China Institute of Water Resources and Hydropower Research, Beijing 100038; 2. Key Laboratory of Water Safety for Beijing-Tianjin-Hebei Region of Ministry of Water Resources, Beijing 100038; 3. School of Earth and Space Sciences, Peking University, Beijing 100871; † Corresponding author, E-mail: zhaojy@iwhr.com

In 2020, Environmental DNA Metabarcoding was used to study the fish diversity in the Huangjinxia section of the upper Hanjiang River, and the historical survey data were compared to construct a fish list in the Huangjinxia section of the upper Hanjiang River. A total of 20 fish species were detected from 9 sampling sites, accounting for 45.45% of the list;,,andare the dominant species. The Shannon index of fish in the upper and lower reaches of the Huangjinxia was significantly different (< 0.01,=9), and the Shannon index of fish in the upper reaches was significantly larger than that in the lower reaches. The main reason for the spatial differences in fish diversity is the Huangjinxia hydraulic hub. The fish composition detected by environmental DNA was similar to that obtained by traditional methods. As an emerging biomonitoring tool, environmental DNA macrobarcoding technology can complement traditional fish monitoring methods to rapidly detect fish diversity and its spatial distribution in the upper reaches of the Hanjiang River.

environmental DNA metabarcoding; fish diversity; Huangjinxia section of the upper Hanjiang River