盆栽蓝莓根际接种内生真菌的效应

李 竹,嵇康轩,原宁欣,王 波

(苏州大学金螳螂建筑学院,江苏苏州,215000)

蓝莓为杜鹃花科越桔属(Vaccinium)果实蓝色的小浆果果树,于20世纪80年代初引入我国进行栽培,目前已形成较大的产业规模[1-2]。蓝莓没有主根,根毛稀少,吸收土壤养分能力较弱。我国大部分栽培地区需要对土壤理化性质进行适当调节,才能满足蓝莓生长需要。如:通过施硫磺来调节土壤pH值,增施生物有机肥等方式[3-5]增强土壤供肥能力。近年来,利用微生物调节土壤环境,促进植物生长的研究越来越多[6-8]。有研究发现,在自然条件下,蓝莓根系可以和内生菌结合,进而改善土壤理化性质,促进植株对营养元素的吸收利用[9-12]。若在土壤中人工添加(接种)内生菌也可以促进蓝莓生长,则将对蓝莓栽培产生深远影响。由此,笔者从健康蓝莓植株根部分离内生真菌,研究其人工添加于土壤对蓝莓根系、光合特性和生物量的影响,以期为内生菌在蓝莓生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试蓝莓品种为“灿烂”,由苏州御湖园农业科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养与分离 选取生长正常的蓝莓根系,用75%乙醇及10%次氯酸钠进行消毒,后将其剪成0.5 cm的根段,接至PDA培养基中,于27 ℃避光培养2周,待根端长出明显菌丝后用接种针转移至新的培养基,反复纯化至单一菌落。

1.2.2 菌株分子生物学鉴定 采用CTBA法提取菌株DNA[11],扩增产物送至苏州鸿迅生物科技有限公司进行测序,将测序结果在NCBI的GenBank数据库中进行BLAST比对分析。

1.2.3 盆栽蓝莓接菌 菌液制备:取新鲜菌块接种于PD培养液中,培养15 d制备菌悬液。取1 mL稀释后的菌悬液(孢子数为1×105个/mL),注入新培养液中,25 ℃、200 转/min摇床培养15 d,待用(孢子数约为8×106个/mL)。

盆栽与接菌:栽培基质为草炭∶松鳞∶珍珠岩=5∶3∶2(体积比),在121 ℃下,经2 h灭菌,待用。试验盆上口径25 cm、底径20 cm、高度17 cm,用75%酒精消毒后风干,每盆装入灭菌基质0.006 m3(约0.5 kg)。取生长相近的两年生蓝莓苗移栽在盆中(2022年6月25日),一盆一株。将上述制备好的菌剂(菌悬液)均匀浇灌至根部(2022年7月1日),每盆20 mL,15 d后再浇一次(20 mL)。试验设置不接菌为对照(CK)。单株小区,每处理40次重复。露天盆栽,盆随机排列,每隔10 d随机交换位置,并将盆旋转180°。其他管理同常规[2]。

1.2.4 测定指标与方法 接菌0、15、30、45、60、75和90 d(7月1日起)时进行相关项目测定,每次每处理随机选3盆(3次生物学重复)。

用便携式叶绿素仪(SPAD-502,日本)测定SPAD值。每株选中部3～5片成熟叶进行测定,避开叶脉,每片叶在叶脉两侧对称部位选择测量6个点。

用便携式光合作用仪(LI-cor 6400,美国)测定光合特性。在晴朗天气上午9:00—11:00进行测定,环境的CO2浓度为420 μmol·mol-1,光照强度为1 200 μmol·m-2·s-1。每株选取自上而下第3-5片完全展开叶(3片叶)进行测定,每株测定3次。

用卷尺测量株高,用游标卡尺测量地径;记录叶片数和分枝数,每个处理重复3次。

用Epson Perfection V700根系扫描仪扫描测定根系构型。将选取的植株从盆中取出,剪取根部,去除附着在根系上的基质,浸泡在去离子水中,用去离子水轻柔清洗,然后将根系放入扫描仪根盘中,加入去离子水,待其完全舒展后,盖上蓝色背景板进行扫描。扫描图片用Rhizo Vision Explorer进行分析处理。

用TCC氧化还原法[13]测定根系活力。

用电子天平(梅特勒-ME204,瑞士)称量植株鲜质量与干质量。

1.2.5 数据分析 采用 SPSS 26.0进行统计分析,用平均值和标准误表示测定结果,对各项结果进行单因素方差分析,采用邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 分离所得内生菌株的鉴定

从蓝莓根部分离出11株内生菌,根据预试验及相关文献选择其中两株进行后续试验。两株菌株分别编号为J1和J6。J1的菌落正面青色,背面青色,呈絮状,轮状生长,生长速度较快。J6的菌落较为蓬松,表面灰色,背面灰黄色,呈丝状(见图1)。

图1 蓝莓健康根部分离菌株J1和J6在PDA培养基上培养的菌落形态

分子生物学鉴定结果表明,J1与GenBank中的Trichodermaasperellum(MT150599.1)的序列覆盖度达到99%,最大序列相似度达到100%,由此鉴定J1为棘孢木霉(T.asperellum)。J6与GenBank中的Mucorcircinelloides(MH855658.1)的序列覆盖度达到100%,最大序列相似度达到99.49%,由此鉴定J6为卷枝毛霉(M.circinelloides)。

2.2 接种内生菌对蓝莓生长发育的影响

2.2.1 叶片SPAD值 试验结果看出,接种75 d内各处理的SPAD值均呈增长趋势,此后基本无变化。接种15～90 d,两个接种内生菌处理的SPAD值均显著高于CK,但接种60 d后接种处理与未接种处理的差距逐渐减小(见表1)。这表明,接种内生菌对提升叶片SPAD值有促进作用,且在处理前期作用较明显,随着处理时间延长,与CK之间的差距逐渐变小。

表1 不同处理对盆栽“灿烂”蓝莓叶片SPAD值的影响

2.2.2 叶片光合特性 接种后各处理同一光合指标随时间的变化趋势相似。接种15～90 d,J1和J6处理的净光合速率均显著高于CK;J1和J6处理的蒸腾速率大多(J1和J6接种30 d,J6接种90 d除外)显著高于CK;J1和J6处理的气孔导度大多(J1接种45 d,J6接种30 d、90 d除外)显著高于CK;J1和J6处理的胞间二氧化碳浓度大多高于CK(J6接种90 d除外)(见图2)。相关性分析结果表明,胞间二氧化碳浓度(Ci)分别与净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)极显著相关(见表2)。

表2 盆栽“灿烂”蓝莓叶片光合参数相关性

表3 不同处理对盆栽“灿烂”蓝莓根系构型的影响

图2 不同处理对盆栽“灿烂”蓝莓叶片光合特性的影响

2.2.3 根系 试验结果表明,接种0～30 d期间各处理根系构型各指标值均增加,J1处理的根面积、根体积和根尖数增幅最大;J6处理的根长和根直径增幅最大。接种30～60 d期间,各处理根系构型各指标值均下降,根直径下降幅度较小,其余4个指标下降幅度较大,且CK的各指标下降幅度均大于J1和J6处理。表明,此时期植物受高温胁迫程度较高。植物根系活力在接种30～60 d期间也发生较大变化,先上升后下降,表明短期高温对植物根活力有一定促进作用,而长期高温胁迫抑制了根系活力。接种90 d时,J1的根面积、根体积以及J6的根体积则继续下降;各处理的根长、根直径和根尖数,CK的根面积和根体积,以及J6的根面积有显著恢复,但部分指标尚未恢复至接种0 d时水平,尤其是CK的根尖数、根体积及根长仍显著低于接种0 d。

接种后,各处理的根系活力变化趋势相似;J1和J6处理的根系活力大多(J1接种45 d除外)高于CK,接种45～90 d根系活力呈现为J6>J1>CK;接种90 d时J6和J1处理的根系活力达到最大值,分别比CK高42.06%和19.03%(见图3)。

图3 不同处理对盆栽“灿烂”蓝莓根系活力的影响

2.2.4 地上部形态指标 试验结果表明,随着接种时间的增加,各处理地上部生长指标均呈增加趋势。接种15～90 d,不同处理的株高呈现为J1>J6>CK。各处理的分枝数主要集中在接种后0～15 d和60～90 d这两个时期增加,与蓝莓生长期吻合;接种15 d时的分枝数呈现为J1>J6>CK,接种30～90 d的分枝数呈现为J6>J1>CK。接种15～90 d,J6和J1的叶片数和地径均显著大于CK,且多数情况为J6>J1(仅接种30 d时叶片数为J1>J6)(见图4)。

2.2.5 生物量 随着接种时间的增加,各处理的全株干质量整体呈上升趋势,接种内生菌促进了干物质的积累。接种15～90 d,J1和J6处理的叶片干质量显著高于CK;J1和J6处理的茎干质量均显著高于CK,且J1处理显著高于J6处理;J1和J6处理的根干质量显著高于CK(见表4)。

表4 不同处理对盆栽“灿烂”蓝莓生物量(干质量)的影响 g

3 讨论

3.1 接种内生菌对蓝莓光合能力的影响

在一般情况下,利用叶片SPAD值能够预测其叶绿素含量[14-15],而叶绿素含量是反映植物光合能力的一个重要指标,通常叶绿素含量越高,植物光合作用能力越强[16],因此,可以根据SPAD值判断植物光合状态和指导氮肥施用[17-19]。本试验发现,接种2种内生菌后一段时期(45 d内)叶片SPAD值显著增加,说明植物光合性能得到了增强[20],而在试验后期各处理叶片趋于成熟,SPAD值差异不大。这与朱江华[21]、欧静等[22]的研究结果类似。

本试验中,接种30～45 d期间净光合速率明显下降。分析其原因,主要是此期苏州地区持续高温(最高气温达40 ℃)且光照较强,地表温度超过40 ℃,对蓝莓产生胁迫,部分新叶出现灼伤现象,导致叶片气孔关闭,气孔导度下降,限制了外界二氧化碳进入,胞间二氧化碳浓度大幅下降,进而导致蓝莓净光合速率显著降低[23]。这与张瑞朋等[24]和吴思政等[25]的研究结果类似。本试验结果表明,接种内生菌,增强了蓝莓植物对强光和高温的适应能力,提高了植物的净光合速率。

3.2 接种内生菌对蓝莓根系生长的影响

根尖是根系最活跃的部分,主要功能是吸收水分及无机盐。根尖数越多,根系对水分及养分的吸收能力越强。同时,根尖数量的增加也为根系伸长提供可能,进而增加根系总体积与总面积。高温胁迫会对蓝莓生理过程产生影响,具体胁迫程度和蓝莓品种、温度有关[26]。在本试验中,接种60 d时外界温度高达40 ℃,已经接近蓝莓半致死温度,根系生长受到抑制,根尖受到高温破坏,数量减少,生长点减少,根长缩短,根面积和体积减小;对比CK,接种内生菌后,根长、根面积、根体积和根尖数下降幅度较小。这说明接种内生菌在一定程度上提高了植物抗性,缓解了高温对植物的损害[27]。有研究表明,植物根系直径和根系活力之间可能存在负相关,即直径越小,活性越大[28]。本试验未发现类似现象,可能是高温胁迫导致该现象不明显。

3.3 接种内生菌对蓝莓形态指标及生物量的影响

植物株高与植物生长量往往存在正相关关系,通过株高能较好地观测植物早期生长状态。赵磊等[29]将毛霉属真菌接种至蓝莓,发现其显著提高了蓝莓株高,本试验接种J1和 J6得到了类似结果。地径是描述植物生长状态的重要指标。本试验结果表明,接种J1和J6均能促进地径增长,与黄秋良等[30]的研究结果类似。植物分枝数和叶片数是衡量生物量累积的重要指标,也是指示植物光合速率的重要依据。一般情况下,分枝数与植物冠幅有关,分枝数越多,越有利于叶片生长,越有利于植物对阳光的利用。本试验结果表明,接种内生菌促进了蓝莓植株分枝数和叶片数的增加。在刘江东[2]的研究中,不同菌株对不同品种蓝莓的促进作用不同,同一菌株对株高、地径等指标的作用效果也不同。本试验中有类似情况:J1对株高促进作用较好,J6处理对地径、分枝数和叶片数的促进作用更明显。这可能是由菌种差异引起的。不同内生菌的功能、特性不同,对植物作用效果也不同,进而影响植物对资源分配的策略。株高能够表征植物垂直方向上利用光照的能力,植物倾向于垂直生长以获取更多的光照资源[31-33]。地径与植物固定支撑、水分吸收有关[34]。J1处理对株高促进作用更好,意味着蓝莓能够获取到更多光照资源,光合速率也更高。J6处理对地径促进作用更明显,对株高促进作用较弱,光合速率低于J1处理,植物需要更多的叶片吸收利用光照,因此,J6处理的植物分枝数和叶片数增量较大。接种两种内生菌对植物鲜质量和干质量积累具有促进作用,这与胡琦鹏等[35-37]的研究结果一致。由于J1和J6处理的最终分枝数和地径较为接近,同时叶片数占生物量比重较小,生物量大小更多取决于株高,因而J1处理在促进生物量积累方面表现更好。

4 结论

从健康蓝莓植株根部分离出11株内生菌。有两株通过形态学和分子生物学分析分别鉴定为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)和卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)。将这两株内生菌的菌悬液浇灌至盆栽蓝莓根际事先灭菌的基质中,对植物形态指标、光合速率、根系生长、生物量均有促进作用。在实际栽培中,可以通过添加内生菌的方式培育更加优良的蓝莓幼苗。