大豆卵磷脂对绵羊精液低温保存效果的影响

黄 晨，李春阳，臧荣鑫，杨具田，石笑迪，高田莉，蔡 元

（西北民族大学，兰州 730030）

纯种的杜泊绵羊可常年发情配种，有较好的繁殖性能，但是从国外引进的纯种数量不多，必须依靠人工授精技术来杂交改良本地绵羊。杂交改良技术常用于国家之间引进优良种质资源进行新品种培育，但是对原有优质种质资源保存最直接的方法就是对精液进行保存。精液保存主要有常温、低温和超低温冷冻保存3 种，冷冻保存是最直接有效的方法。绵羊精子对低温非常敏感，目前为止，绵羊精液冷冻保存技术尚不能在生产中大面积推广应用。常温保存则仅适用于短时间保存，相对来说低温保存的成本较低、效果较佳。

液态低温保存下精子代谢减弱，可延长精子的存活时间，在温度恢复正常后代谢也随之恢复并且仍具有受精能力［1］，然而在降温和升温过程中会对精子造成不可逆的伤害，需要在稀释液中添加保护剂。在低温保存中常用的保护剂主要为动物源性保护剂，如卵黄，它们可使精子在降温过程中免受伤害［2］，然而在近年来的研究中发现，动物源性保护剂会导致疾病的传播［3］，母鸡的营养水平和健康状况也会导致每个批次所生产的卵黄质量不一，并且在运输过程中也存在疾病传播的风险，因此促使人们去寻找可代替卵黄的物质［4］。其中大豆卵磷脂的成分更加容易标准化和易获得，而且不会有细菌污染［5］，因而已成为卵黄的有效代替物，它可以有效减少胆固醇和磷脂外流，从而在低温状态下保护精子膜。因此，本试验在无动物源性稀释液中添加不同含量的大豆卵磷脂，探究其在低温状态下对精子的保护效果，从而为大豆卵磷脂能否代替卵黄并应用于生产实践提供参考。

1 材料

1.1 试验动物

选择稼鸿养殖专业合作社体况良好，具有正常繁殖能力的成年杜泊绵羊4只作为试验动物。

1.2 试验药品

葡萄糖：烟台市双化工有限公司生产；蔗糖：天津市光复精细化工研究所生产；柠檬酸钠：天津市光复精细化工研究所生产；大豆卵磷脂：浙江道格凯特实业有限公司生产；卵黄：浙江道格凯特实业有限公司生产；硫酸链霉素：浙江道格凯特实业有限公司生产；青霉素：哈药集团制药总厂生产。

1.3 试验器具

集精杯、假阴道、玻璃棒、试管、冰箱、移液枪、100 mL 容量瓶、温度计、水浴锅、显微镜、干燥箱、冰袋、载玻片、盖玻片、电子天平、漏斗、滤纸、冷暖箱，均来自西北民族大学生命科学与工程学院动物生产与管理实验室。

2 方法

2.1 精液稀释液的配制

将稀释液按表1配制后置于4℃保存备用。

表1 100 mL精液稀释液的配方

2.2 精液的采集

采用假阴道法采集精液，将安装好的假阴道用75%的酒精棉球擦拭消毒，从注水孔处灌入48～55℃温水调节假阴道内腔的压力，使其阴茎插入端呈饱满的三角形、松紧适度并富有弹性为宜。同时插入端的1/3处由外向里、由厚及薄地涂抹凡士林，最后测量假阴道内测的温度，在38～42℃范围内就可采精。

2.3 精液的保存和处理

采精结束后，通过肉眼观察精液色泽是否为乳白色或浅黄色，并且产生上下翻滚的云雾状现象，检查合格后放入预温的集精杯中用毛巾包裹放入泡沫箱带回实验室，在15 min 内完成精液品质的检测，选择活力在0.8 以上、密度为2.5×109左右的精液进行稀释，将稀释液与精液放在37℃水浴锅中进行等温处理，按4∶1 的比例将稀释液缓慢地沿杯壁加入精液中，防止精子受到损伤。精液稀释后，先在暗处静置平衡0.5 h，然后裹上8 层纱布放入4℃的冰箱中保存备用。每间隔12 h 镜检精子活率，直至精子全部死亡，统计精子的有效存活时间、总存活时间和生存指数，在第48 小时对精子进行染色，测定顶体完整率和畸形率。

2.4 精液品质检查

2.4.1 精子活率

用平板压片法测定精子的活率，取等温生理盐水与精液按3∶1 稀释，将载玻片置于400 倍下镜检，每次计数至少200 个精子，测定直线运动的精子占总精子数的百分比，每个试验组做5 个生物学重复。

2.4.2 存活时间

有效存活时间是指精子活率在0.3 以上的保存时间。总存活时间是指精子全部死亡的时间。

2.4.3 顶体完整率

采用姬姆萨染色法测定顶体完整率，将保存24 h的精液置于37℃水浴锅中孵育，充分混匀后取一滴中层精液制作抹片，在自然条件下进行风干，之后用福尔马林磷酸盐固定液固定15 min，用蒸馏水洗去固定液后进行风干。最后Giemsa 染色液染色15 min，用蒸馏水洗净后风干，等待镜检。每张片子计数300 个精子，观察精子顶体形态，计算其完整率，每个试验组做5 个生物学重复。

2.4.4 精子畸形率

采用酸性复红美蓝法测定精子畸形率，将保存24 h的精液置于37℃水浴锅中孵育，充分混匀后取一滴中层精液制作抹片，在自然条件下进行风干，之后无水乙醇固定2～3 min 后风干。将其全部浸入0.5%的氯胺T中1～2 min，水洗后迅速通过96%的乙醇，风干后放入石碳酸复红染色液中，在清水中蘸2 次，之后迅速通过美蓝染色液，最后水洗风干，等待镜检。每张片子计数300 个精子，观察精子形态，计算其畸形率，每个试验组做5个生物学重复。

2.5 数据统计与分析

试验数据通过Excel 2010 整理后，利用SPSS 25.0的One-way ANOVE 进行单因素方差分析，结果用平均数±标准误差表示，P＜0.05为差异显著。

3 结果与分析

3.1 不同含量大豆卵磷脂对杜泊绵羊精子有效存活时间、总存活时间和生存指数的影响

由表2可知，1.875 g/L组精子的有效存活时间显著高于其他各组（P＜0.05），7.500 g/L 组和15.000 g/L 组的有效存活时间显著低于对照组（P＜0.05），3.750 g/L组的有效存活时间显著高于15.000 g/L 组（P＜0.05），其余各组之间差异均不显著（P＞0.05）；1.875 g/L 组的总存活时间显著高于其他各组（P＜0.05），7.500 g/L 组和15.000 g/L 组的总存活时间显著低于对照组（P＜0.05）和3.750 g/L 组（P＜0.05），其余各组之间差异均不显著（P＞0.05）；1.875 g/L 组精子的生存指数显著高于其他各组（P＜0.05），3.750 g/L 组、7.500 g/L 组和15.000 g/L组的生存指数均显著低于对照组（P＜0.05），而3.750 g/L 组的生存指数显著高于7.500 g/L 组（P＜0.05）和15.000 g/L组（P＜0.05），7.500 g/L组与15.000 g/L组之间差异不显著（P＞0.05）。由此说明，大豆卵磷脂的含量为1.875 g/L 时最有利于绵羊精液的低温保存，并且随着含量的增加会显著降低绵羊精子低温保存的总存活时间、有效存活时间和生存指数。

表2 精子的有效存活时间、总存活时间和生存指数

3.2 不同含量大豆卵磷脂对杜泊绵羊精子顶体完整率、畸形率的影响

由表3 可知，1.875 g/L 组的精子顶体完整率最高，高于对照组（P＞0.05）和15.000 g/L 组（P＜0.05），其余各组之间差异均不显著（P＞0.05）；1.875 g/L 组的精子顶体畸形率最低，显著低于7.500 g/L 组（P＜0.05）和15.000 g/L 组（P＜0.05），对照组的畸形率也显著低于15.000 g/L 组（P＜0.05），其余各组之间差异均不显著（P＞0.05）。由此说明，大豆卵磷脂含量为1.875 g/L时能够提升精子的顶体完整率，降低精子的畸形率，但是随着含量的增加会使精子的顶体完整率降低、畸形率增加。

表3 精子的顶体完整率及畸形率

4 讨论

4.1 不同含量大豆卵磷脂对杜泊绵羊精子有效存活时间、总存活时间和生存指数的影响

精液在保存时受温度、精子浓度、稀释液pH值、渗透压等环境的影响［6］。2004 年毛凤显等［7］提出，绵羊精液的抗冻能力差，对温度较为敏感，所以温度对其保存效果的影响备受关注。在精液的低温保存过程中，会因为温度变化而出现冷应激，造成精子的不可逆死亡，同时精子在低温保存过程中会产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）［8］，使膜发生脂质过氧化，进而影响新陈代谢，最终诱发精子的损伤及凋亡［9］。因此，在精液低温保存时一般需要外源性保护剂来防止低温打击并提供精子代谢所需的营养，卵黄为最常用的外源性保护剂，已被广泛应用于精液保存稀释液中。但是因为其生产批次不同，对精液保存的效果也会不同，所以国内外研究人员都在寻找可代替卵黄的保护剂。目前研究较多的是植物源性的大豆卵磷脂，卵黄和大豆卵磷脂中可作为保护剂的成分均为卵磷脂，但大豆卵磷脂性能稳定，且不存在潜在传播疫病的风险，可为大规模商业化生产稀释液提供便利。

在本次试验中，在低温条件下用含有大豆卵磷脂的稀释液保存绵羊精液，发现大豆卵磷脂对黑头杜泊绵羊精子的存活时间有一定的影响。通过数据分析可知，不同含量的大豆卵磷脂对精子的总存活时间、有效存活时间均有比较显著的影响，其中大豆卵磷脂的添加量为1.875 g/L 时绵羊精子的生存指数最高，因为该组中的总存活时间和有效存活时间比对照组高。但是随着其含量的进一步增加，精子的存活时间显著下降甚至低于对照组，因此大豆卵磷脂含量的增加与存活时间呈负相关，说明高含量的大豆卵磷脂并不适合精子的存活，可能是因为大豆卵磷脂难溶于水，浓度过高达到饱和时，溶解能力变小，使稀释液变得粘稠，精子运动时会消耗大量的能量，从而对精子的生存性能产生不利的影响。

4.2 不同含量大豆卵磷脂对杜泊绵羊精子顶体完整率、畸形率的影响

精子的顶体完整率与精子穿过卵膜的能力相关。在受精过程中当精子到达卵丘细胞表面时，精子顶体通过释放蛋白分解酶，溶解卵子外部的透明带以及放射冠，当精子顶体缺失时，精子头部不能进入卵丘，从而受精失败［10］。而透明质酸是卵子和透明带粘液基质的主要成分，只有成熟的精子才可以与透明质酸结合，而精子畸形率会使精子成熟的可能性降低，因此过高的畸形率也会导致受精失败［11］。在本试验中1.875 g/L 大豆卵磷脂组的精子顶体完整率最高，高于对照组，且显著高于15.000 g/L 大豆卵磷脂组，说明大豆卵磷脂对精子的顶体具有一定的保护功能，其可增加细胞膜的通透性，从而修补因为氧化应激功能造成的膜损伤，但是当大豆卵磷脂浓度为15.000 g/L 时，精子的顶体完整率显著下降，说明在精液稀释液中大豆卵磷脂的添加量有一定的范围限制，超过这一范围会对精子保护产生负作用。通过对精子畸形率的分析可知，大豆卵磷脂的添加量为1.875 g/L时畸形率最低，但是随着浓度的增加大豆卵磷脂会使畸形率升高，低浓度的大豆卵磷脂有降低精子畸形率的趋势，可能是其他成分与大豆卵磷脂的抗氧化性综合作用的结果，这一结果与孟娜娜［12］的研究结果一致。

卵黄对精子细胞膜的保护作用主要依靠卵磷脂，磷脂是细胞膜的主要组成部分［13］，可在降温过程中保护精子膜。卵黄作为动物源性的保护剂存在潜在传播疫病的风险，同时母鸡的营养水平和健康状况的不同会导致卵黄质量不稳定，进而影响精液的应用和保存效果，所以用植物源性的大豆卵磷脂可避免这些不确定因素。大豆卵磷脂中磷脂含量低于卵黄，但不饱和脂肪酸含量却远高于卵黄，不饱和脂肪酸对生物膜也起着保护作用［14］。

5 结论

在稀释液中添加1.875 g/L的大豆卵磷脂可以延长精子的存活时间，提高绵羊精液低温保存的质量，说明该含量的大豆卵磷脂可代替卵黄。