豆科绿肥作物害虫苜蓿叶象甲的鉴定与预警

孙佳琦 张蕾 侯阳阳 谢殿杰 刘悦秋 江幸福

摘要

苜蓿葉象甲Hypera postica是我国苜蓿Medicago sativa上的重要害虫，主要分布在新疆、甘肃、内蒙古等畜牧业主产区。作者2023年4月在安徽省芜湖市南陵县调查紫云英Astragalus sinicus虫害时，在当地紫云英留种田中发现疑似苜蓿叶象甲严重为害紫云英茎叶，对紫云英生长和产量产生严重影响。为明确该种害虫的分类地位，在田间收集了幼虫并带回室内饲养，在对幼虫和成虫形态学初步鉴定的基础上，采用DNA条形码进行了分子鉴定，最终确定为苜蓿叶象甲，且发现该地区苜蓿叶象甲种群存在明显的种内分化。结合苜蓿叶象甲的生物学与生态学特性，对其在我国的传播及其对绿肥作物的危害做出了预警，并提出了防治建议。

关键词

苜蓿叶象甲; 豆科绿肥; 形态学鉴定; 分子鉴定; 预警与防治

中图分类号： S 433.5

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2023527

Identification and early warning of Hypera postica （Coleoptera： Curculionidae）， a severe pest of legume cover crops

SUN Jiaqi1#， ZHANG Lei1#， HOU Yangyang1， XIE Dianjie1， LIU Yueqiu2， JIANG Xingfu1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， 

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. College of Landscape Architecture， 

Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

The alfalfa leaf weevil， Hypera postica， is an important pest of alfalfa crops in China， particularly in major livestock production regions such as Xinjiang， Gansu， and Inner Mongolia. During an investigation of pest causing damage to Astragalus sinicus in Nanling county， Wuhu city， Anhui province， suspected traces of ;H.postica were discovered in local seed fields， where the stems and leaves of A.sinicus were severely damaged by the insect. To clarify the classification status of this pest， the larvae were collected and brought back to the laboratory for rearing. Preliminary identification of both larvae and adults was conducted based on morphological characters， and then molecular identification was performed using DNA barcodes， confirming the insect as the alfalfa leaf weevil， H.postica. Furthermore， it was found that there were significant intraspecies variations within the local population. According to the biological and ecological characteristics of H.postica， a warning has been issued regarding the potential spread of this pest in China and its detrimental impact on cover crops， and insect pest control suggestions were also proposed.

Key words

Hypera postica; legume cover crops; morphological identification; molecular identification; early warning and control

苜蓿叶象甲Hypera postica是全球苜蓿Medicago sativa上重要害虫之一，主要分布在欧洲各国、美国、加拿大、墨西哥和日本等地［12］。1904年美国首次发现该虫传入为害［3］，20世纪60年代苜蓿叶象甲在美国苜蓿上成灾，造成苜蓿种植面积大幅缩小，仅弗吉尼亚州苜蓿种植面积由1961年的4.25万 hm2缩减至1967年的1.34万 hm2 ［4］。大发生年份造成经济损失达25亿美元［56］。我国苜蓿叶象甲主要分布在新疆、甘肃和内蒙古等地，曾对我国苜蓿生产和畜牧业造成毁灭性危害［78］。苜蓿叶象甲不仅为害苜蓿，还可取食豆科、十字花科、禾本科、菊科、蔷薇科等植物［9］。全球气候变化与作物种植结构调整是昆虫种群分布发生变化的关键因素［10］。依据气候数据对我国苜蓿叶象甲的适生区进行分析发现，从2010年至2020年苜蓿叶象甲在我国的适生区出现西扩南移的扩散态势［9］。当前，随着国家土地质量提升行动的开展和可持续农业发展需求，我国绿肥作物特别是豆科绿肥的种植面积不断扩大，给苜蓿叶象甲提供了潜在的寄主植物资源［1112］，这也预示着多食性害虫对绿肥作物存在潜在危害的风险。

紫云英Astragalus sinicus是我国重要的豆科绿肥作物，近年来在我国江淮流域和沿江江南等地大力推广种植，目前在安徽、江苏、山东等地种植面积超67万 hm2。长年连续种植造成病虫害发生加剧，特别是在紫云英种子生产田，虫害是造成其种子减产的重要原因［12］。在国家绿肥产业技术体系支持下，2023年3月作者在安徽省芜湖市南陵县弋江镇调查紫云英虫害时，在紫云英留种田中发现疑似苜蓿叶象甲，且严重为害紫云英茎叶，估算为害面积约为66.67 hm2（图1）。为明确紫云英这一重发害虫的分类地位，作者在田间收集了幼虫并带回室内饲养，通过形态学和分子生物学（DNA条形码）对其进行物种鉴定，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2023年3月25日在安徽省芜湖市南陵县弋江镇（30°51′ N， 118°27′ E）紫云英田采集象甲幼虫，并将幼虫带回实验室置于（22±1）℃， 相对湿度55%～70%的养虫室内使用紫云英苗饲养。

1.2 形态鉴定

使用体视显微镜（SZX7， OLYMPUS）对象甲幼虫和成虫进行图像采集，参考《苜蓿病虫害识别与防治》［13］以及有关苜蓿叶象甲形态特征报道的文献等资料，对幼虫和成虫的形态进行比对鉴定，以初步确定物种名称。

1.3 DNA条形码鉴定

使用EasyPureGenomic DNA Kit（EE10112， 北京全式金生物技术股份有限公司），按照说明书单头提取象甲幼虫的基因组DNA，共提取3头。提取后使用NanoDrop One/OneC （Thermo）超微量紫外分光光度計检测DNA的浓度和纯度，以保证提取的DNA质量完好，DNA样品-20℃保存用于后续PCR扩增。采用COⅠ基因通用引物LCO1490（5′

GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′）和

HCO2198

（5′TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）扩增长度为658 bp的COⅠ基因部分片段［14］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应体系为：2 × EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，超纯水10.5 μL。扩增条件为：95℃ 5 min;94℃ 40 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环;72℃ 10 min。PCR产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，挑选具有单一条带的PCR产物使用上下游引物进行双向测序，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序结果由SeqMan软件进行拼接并手工校正后在NCBI数据库中BLAST以确定序列为目的基因序列并完成物种鉴定。

1.4 系统进化分析

从NCBI数据库中搜集前人提交的苜蓿叶象甲COⅠ基因序列（KY796624、MK891455、OL664242、KY796640）和其5个近缘种H.conmaculata （KC783982）、H.striata （KM441151）、H.viciae （KU912420）、H.venusta （KU912617）、Brachypera dauci （KJ964617）的COⅠ基因序列。使用DNAMAN软件将本研究的苜蓿叶象甲COⅠ基因序列与搜集到的象甲COⅠ基因序列进行比对，获得各物种间的相似性。使用MEGA 11软件对所有序列进行比对分析，去除冗余序列后计算遗传距离，再利用近邻相接法（neighborjoining， NJ）构建系统发育树，并设置bootstrap抽样1 000次进行检验，其余参数设为默认值。使用MEGA 11软件分析本研究苜蓿叶象甲COⅠ基因的核苷酸及其编码的氨基酸组成。

2 结果与分析

2.1 形态学特征分析与鉴定

本研究的幼虫和成虫与《苜蓿病虫害识别与防治》［13］、Pellissier等［15］和Germann［16］报道的苜蓿叶象甲形态基本一致（图2）。成虫：黄褐色，体长4.4～6.6 mm，宽2.0～2.6 mm，头部黑褐色，喙细长呈管状，触角11节，膝状，端部膨大。前胸背板有2条

较宽的褐色纵条纹，中间夹有1条细的灰线。鞘翅上有3段深褐色纵条纹，中间的1段纵条纹最长。足细长，腿节稍粗，上有小齿（图2a）。老熟幼虫：体长8～10 mm，深绿色，头黑色，背部中央具有1条从头部延伸至尾部的深白色背线，两侧各有1条浅白色纵线。幼虫无足，行动是靠腹面刚毛的瘤状突迅速爬行，幼虫具假死习性，受惊后蜷缩成“C”形（图2d）。幼虫易与三叶草叶象甲H.punctata幼虫混淆，但三叶草叶象甲幼虫头为棕褐色且背部中央白线边缘有粉红斑点（图2g）。

成虫和幼虫均可取食为害紫云英。成虫取食紫云英叶片或茎秆并产卵于茎秆内。初孵幼虫在茎秆中蛀食为害，形成黑色虫道;2龄时钻出茎秆取食叶芽和花芽，3龄和4龄为害最为严重，大量取食枝叶，仅残留叶脉，影响紫云英光合作用、干物质积累及其固氮效果，使紫云英产量及其生态效应大幅降低（图1a）。

2.2 DNA条形码鉴定与分析

对测序的3条序列进行校正，得到长度均为658 bp的序列，在NCBI数据库中进行BLAST发现，象甲NL1、NL3与数据库中苜蓿叶象甲的COⅠ基因序列（登录号：KY796624）相似性为100%;而象甲NL2与数据库中另一个苜蓿叶象甲的序列（登录号：KY796640）相似性为100%;BLAST结果进一步证实了本研究中的象甲为苜蓿叶象甲（图3）。

2.3 分子系统进化分析

苜蓿叶象甲NL1和NL3与Hypera conmaculata、H.striata、H.viciae、H.venusta、Brachypera dauci的COⅠ基因核苷酸序列的相似性依次均为90.43%、87.39%、89.67%、87.69%、85.71%，遗传距离分别均为0.104、0.144、0.112、0.137、0.161;而NL2与这5种近缘种的COⅠ基因核苷酸序列的相似性依次为91.19%、88.45%、90.12%、89.51%和86.47%，遗传距离分别为0.095、0.129、0.107、0.116、0.152（表1）。而NL1和NL3间的遗传距离和相似性分别为0和100%，且两者与NL2的遗传距离和相似性分别均为0.061和94.22%，NL1、NL2和NL3的两两间遗传距离均远小于其与5种近缘种的，而相似性均远大于其与5种近缘种的（表1）。

1） 表中左下数据为8个象甲COⅠ基因序列的平均遗传距离，右上为8个象甲COⅠ基因序列的相似性（%）。

The data in the lower left half of the table are the average genetic distance of the COⅠ gene sequences of eight weevils. The data in the upper right half of the table show the similarity （%） of the COⅠ gene sequences of eight weevils.

采用NJ法對本研究中3条苜蓿叶象甲的COⅠ基因序列与NCBI数据库中的4条苜蓿叶象甲COⅠ基因序列和5条近缘种COⅠ基因序列构建系统进化树（图4）。由系统进化树可知，本研究的苜蓿叶象甲与同属的近缘种明显地区分开来，本研究的苜蓿叶象甲与其他学者提交的苜蓿叶象甲单独聚为一大支，这进一步表明本研究的象甲为苜蓿叶象甲。此外，有趣的是本研究的3条苜蓿叶象甲序列聚在不同支上，说明本研究采集的苜蓿叶象甲可能存在明显的种内分化（图4）。

本研究中3条苜蓿叶象甲COⅠ基因的核苷酸序列比对结果显示NL1、NL2、NL3三者间的相似性为98.08%，3条序列间共存在38个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点，所有位点总突变数为25，其中发生转换的位点数为20，发生颠换的位点数为5，转换/颠换偏倚率为3.8，所有序列碱基平均含量分别为A 30.9%、G 15.6%、C 16.1%、T 37.4%（图5）。

本研究中3条658 bp的苜蓿叶象甲COⅠ基因编码的氨基酸序列比对结果显示序列均编码219个氨基酸，相似性高达99.85%，其中在第166个氨基酸位点出现了变异，NL1与NL3在该位点编码苏氨酸（threonine），NL2在该位点编码丙氨酸（alanine）。

3 讨论

3.1 警惕苜蓿叶象甲在我国进一步传播为害

气候变化显著影响苜蓿叶象甲在我国的适生区变化［9］，2010年苜蓿叶象甲在我国适生区为西北、东北、华北、华中和西南等大部分地区，2020年其适生范围已西扩至西藏中南部，高度适生范围南扩至33°N，全国非适生区范围减少5.02%。作物种植结构也能够对害虫种群分布产生巨大影响［10］。在国家绿肥产业技术体系的大力示范推广下，南方稻田种植紫云英的面积逐年扩大，这在一定程度上为某些植食性昆虫提供了食物资源［1112］。尽管周丹等［18］和浦杏琴等［19］分别报道了苜蓿叶象甲为害南方稻田紫云英及其防治方法，但均侧重于防治药剂的筛选，而忽视了害虫的物种鉴定与种内分化。由于苜蓿叶象甲与同属的H.temperei、H.postica、三叶草叶象甲等在形态特征上极为相似，易出现识别错误［1617］。特别是目前已有报道均指出我国苜蓿叶象甲主要分布在新疆、甘肃、内蒙古等西北牧区［7，9］。因此，明确南方稻田紫云英上相似物种十分必要。本研究通过形态学与分子鉴定相结合的方式首次明确了我国南方稻田紫云英重发害虫为苜蓿叶象甲，确定了苜蓿叶象甲已经传入我国南方并严重为害绿肥作物，拓展了对我国苜蓿叶象甲地理分布的认识，首次发现我国南方苜蓿叶象甲存在明显的种内分化。

3.2 警惕苜蓿叶象甲对豆科绿肥作物造成危害与损失

苜蓿叶象甲是一种重要的畜牧业害虫，主要为害苜蓿、红三叶草Trifolium pratense等豆科植物、也可取食禾本科、十字花科、菊科、蔷薇科等植物，还能为害玉米Zea mays和马铃薯Solanum tuberosum等主粮作物［9］。欧洲和美国等西方国家主要指出了苜蓿叶象甲是苜蓿的重要害虫，很少报道对紫云英的危害。而在日本，1982年发现苜蓿叶象甲为害紫云英，随后迅速传播成为紫云英的重要害虫，严重威胁当地的蜂蜜产业［1，20］。根据浦杏琴等［19］的调查结果可知，2022年3月江苏武进地区苜蓿叶象甲已严重为害紫云英和救荒野豌豆Vicia sativa等。这恰好与同年3月作者在安徽南陵紫云英田观察到的现象一致（图1），表明苜蓿叶象甲已在我国南方绿肥作物田中广泛分布并取食为害绿肥作物。这警示苜蓿叶象甲可能已成为豆科绿肥作物的重要害虫，严重威胁绿肥生产及其应用，生产上需加以重视。

3.3 加强苜蓿叶象甲传播途径与监测预警研究

苜蓿叶象甲起源于欧洲、亚洲和非洲等旧大陆，而后通过多种方式引入美洲，现已遍布全球多个国家［2］。依据线粒体上两段基因序列（COⅠCOⅡ、CyBND1）的差异，苜蓿叶象甲可以分为Western、Eastern、Egyptian、Xinjiang等4个品系，且品系间难以依靠形态特征区分［2122］。美国已分布有Western、Eastern和Egyptian品系，均由欧洲或亚洲引入;日本主要有Western和Egyptian品系，在这些国家中既有单一品系独存的地域，也有两个品系共存的地区［2324］。本研究的系统进化树表明我国紫云英田苜蓿叶象甲存在明显的种内分化，存在38个SNP位点，其中有25个为突变位点。通过对品系鉴定基因COⅠCOⅡ和CyBND1的测序与比对，我们发现本研究中NL1和NL3为Western品系，NL2为Egyptian品系（未发表），由于本次采样的样品较少和样点单一，我国可能还存在未被发现的品系。值得注意的是，本研究在安徽南陵取样的苜蓿叶象甲不是我国Xinjiang品系，表明其并非来源于新疆地区。由于苜蓿叶象甲在我国适生区广袤，而这些适生区中是否存在苜蓿叶象甲及其品系组成等情况均不清楚，导致无法推测我国南方紫云英田中苜蓿叶象甲的来源地，可能源于国内其他地区也可能来源于境外。但依据Flanders［25］和李新芳等［26］的报道，并结合近年来我国苜蓿进口量逐年攀升等背景，推测本研究中NL2极大可能是由国外传入。因此，探明全国适生区内苜蓿叶象甲的种群状况对掌握该虫的地理分布与扩散规律至关重要。同时要加强苜蓿叶象甲的监测预警，尤其在新疆、甘肃、内蒙古等高度适生区，需要进一步加强对其监测预警体系的建设。

3.4 加强苜蓿叶象甲的综合防治

目前，我国南方紫云英已经出现苜蓿叶象甲局地暴发为害的趋势，因此，豆科绿肥作物亟须进行害虫监测与防治。具体防治方法可参考有关文献报道。1）化学防治：在低龄幼虫发生高峰期，每667 m2施用10%联苯菊酯乳油20 mL，防治效果可达100%［1819］;或者采取2.5%高效氯氟氰菊酯乳油1 500倍、2.5%溴氰菊酯乳油2 000倍、48%毒死蜱乳油1 000倍、4.5%高效氯氰菊酯乳油1 500倍交替噴雾防治［27］。2）生物农药防治：10%多杀霉素悬浮剂喷雾，施药后3 d防效可达80%以上［28］。3）植物源药剂防治：30%茶皂素水剂，施药后3 d防效可达75%以上［28］。注意用药时间，尽量提前施药以减少对天敌昆虫的负面影响［29］，药剂应当交替使用，严禁在同一地块连续使用同种农药，以减缓抗药性的产生［30］。

在生物防治方面，虽然有很多苜蓿叶象甲的寄生性天敌和病原菌，如短窄象甲姬蜂Bathyplectes anurus［15］、苜蓿叶象姬蜂B. curculionis［15］、姬蜂B. stenostigma［15］、苜蓿啮小蜂Oomyzus incertus［31］、虫瘟霉Zoophthora phytonomi［32］、白僵菌Beauveria bassiana［33］、苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis［34］等，但苜蓿叶象甲对这些生防因子的抵抗力因品系不同可能截然相反［35］。所以，探明全国苜蓿叶象甲的品系分布对其精准防治具有直接的现实意义。能够依据当地苜蓿叶象甲的品系构成情况针对性地释放生防因子，达到节本增效的目的。

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