高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响

徐庆 王奥霖 聂晓 刘伟 张昊 曹世勤 范洁茹 周益林

摘要

為探究高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响，本研究测定了禾谷镰孢5株耐高温菌株和4株温度敏感型菌株在25℃和30℃下的菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率以及不同胁迫压力下的生长速率、致病力和DON毒素含量等。结果表明，不论耐高温菌株还是温度敏感型菌株，30℃高温对其菌丝生长均有抑制作用，但对产孢量和孢子萌发有促进作用;30℃高温能减轻NaCl和CaCl2胁迫对禾谷镰孢生长的抑制，但是不影响KCl、刚果红，SDS和H2O2对病原菌的抑制作用;在30℃下，大部分耐高温菌株的致病力不变或降低，而大部分温度敏感型菌株的致病力反而增加，30℃对大部分菌株的DON毒素产量有一定促进作用。研究结果可为研究气候变化下小麦赤霉病的流行和预测提供理论基础。

关键词

禾谷镰孢; 高温胁迫; 渗透胁迫; 致病力; DON

中图分类号：

S 432.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022141

The effect of heat stress on the growth and aggressiveness of Fusarium graminearum isolates

XU Qing1，2， WANG Aolin2， NIE Xiao2， LIU Wei2， ZHANG Hao2，CAO Shiqin1，3*， FAN Jieru2*， ZHOU Yilin2

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China; 2. Institute of Plant Protection， 

Chinese Academy of Agricultural Sciences， State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， 

Key Laboratory of Control of Biological Hazard Factors （Plant Origin） for Agricultural Product Quality and Safety， 

Beijing 100193， China; 3. Wheat Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， China）

Abstract

In order to explore the effect of heat stress on the growth and aggressiveness of Fusarium graminearum， we measured the mycelia growth， sporulation， spore germination， osmotic stress， aggressiveness and DON production of five heattolerant isolates and four heatsensitive isolates at 25℃ and 30℃. The results showed that the mycelial growth was inhibited but the sporulation and spore germination were promoted at 30℃ for both heattolerant and sensitive isolates. The high temperature （30℃） treatment reduced the inhibition caused by NaCl and CaCl2 osmotic stress to the growth of F.graminearum isolates， but showed no effect on the inhibition caused by KCl， Congo Red， SDS and H2O2 stress. Furthermore， the aggressiveness remained unchanged or decreased at 30℃ in most heattolerant isolates， while increased in most heatsensitive isolates， and high temperature （30℃） had a certain promoting effect on the production of DON toxins in most isolates. This study provides a theoretical basis for the prevalence and forecasting of Fusarium head blight under climate change.

Key words

Fusarium graminearum; heat tolerance; osmotic stress; aggressiveness; DON

禾谷镰孢Fusarium graminearum Schwabe是小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）的主要致病菌之一。小麦赤霉病在我国1936年首次报道，近年来，由于气候、耕作制度变化等的影響，小麦赤霉病在我国长江中下游和黄淮海麦区频繁发生，近五年，全国年均发病面积300万～600万hm2，约占小麦种植面积的20%，对小麦安全生产构成了严重威胁［14］。禾谷镰孢侵染小麦后不仅会导致作物产量降低，还会在感病小麦籽粒中产生一系列真菌毒素，如：脱氧雪腐镰孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、雪腐镰孢菌烯醇（nivalenol，NIV）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等，造成食品安全问题［5］。

温度作为重要的环境因素，不仅影响作物生长，也影响病原菌的生存、繁殖。已有研究报道，温度会影响镰孢菌在田间分布的种类和菌群结构，进而影响病害的发生，如Saremi等［6］通过研究镰孢菌田间种群密度和温度等气象因子之间的关系，证明了温度等气象因子在镰孢菌的生态学性状如产孢量、孢子萌发、致病力等方面起重要作用。纪莉景等［7］通过测定不同温度下假禾谷镰孢Fusarium pseudograminearum的生物学性状，确定了其菌丝生长温度范围为4～30℃，最适温度为28℃;假禾谷镰孢孢子萌发的温度范围为4～35℃，分生孢子萌发的温度范围为12～30℃。赵亚男［8］采用菌丝生长速率法，明确了小麦赤霉病菌F.asiaticum和F.graminearum在不同温度下生长的速率及温度敏感性，两个种群生长的最适宜温度均为25℃，22℃和28℃次之，30℃生长速率降低，32℃下生长速率显著受到抑制。综上，温度对镰孢菌的生长有影响，但高温胁迫对禾谷镰孢产孢、孢子萌发、渗透压胁迫、致病力和产毒素方面的影响鲜有报道。

因此，本文研究了常温25℃和高温30℃胁迫下，不同温度敏感型禾谷镰孢菌株在菌丝扩展、产孢量、孢子萌发、渗透压胁迫、致病力和产DON毒素量等方面的差异，以明确高温胁迫对病原菌生长发育和致病力的影响，并明确耐高温菌株抵御高温的侵染阶段和生理特点，为研究气候变化下小麦赤霉病的流行预测提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

禾谷镰孢菌株：共9株，为2018年采自湖北省襄阳市和荆州市不同区（县）感染小麦赤霉病的小麦病穗的单孢分离物［8］，由中国农业科学院植物保护研究所和湖北省农业科学院植保土肥所提供。

1.2 供试培养基

SNA培养基：1 g KH2PO4，1 g KNO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，0.2 g 葡萄糖，0.2 g 蔗糖，20 g 琼脂粉，补水至1 L。

PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，补水至1 L。

WA培养基：10 g琼脂粉，5 g葡萄糖，补水至1 L。

绿豆汤培养基：30 g绿豆用蒸馏水煮沸10 min，4层纱布过滤，补水至1 L。

TBI培养基：30 g 蔗糖，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，10 mg FeSO4·7H2O，0.871 g 精氨酸，200 μL微量元素［5 g ZnSO4·7H2O，0.25 g CuSO4·5H2O，50 mg MnSO4·H2O，50 mg H3BO3，5 g柠檬酸，50 mg Na2MoO4·2H2O，ddH2O定容至100 mL搅拌充分，用直径 25 mm 的玻璃纤维滤纸及配套过滤器（Whatman GF/A）过滤除菌，4℃保存］，磁力搅拌器搅拌均匀，蒸馏水定容至1 L。

所有培养基均121℃，高压灭菌20 min后备用。

1.3 试验方法

1.3.1 禾谷镰孢菌株活化和孢子悬浮液的制备

菌株活化：将保存的菌株接种于PDA培养基中央，25℃培养箱中黑暗培养4～5 d，从菌落边缘打取菌饼接种到新的PDA平板上培养，待用。

孢子悬浮液制备：用直径5 mm打孔器在活化的菌株菌落边缘打取数个菌饼，置于30 mL绿豆汤培养基中，25℃，175 r/min振荡培养5 d，灭菌的4层擦镜纸过滤，4 000 r/min 3 min浓缩富集，无菌ddH2O清洗两次，备用。

1.3.2 高温胁迫对禾谷镰孢菌丝生长的抑制

采用菌丝生长速率法。在已活化的菌株菌落边缘打取5 mm菌饼，接种于直径90 mm的SNA平板上，置于25℃和30℃黑暗培养，每处理重复3次，培养6 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算高温胁迫抑制率。

抑制率=25℃菌落直径-30℃菌落直径25℃菌落直径-菌饼直径×100%。

1.3.3 高温胁迫下禾谷镰孢产孢量测定

采用绿豆汤振荡培养法。在已活化的菌株菌落边缘打取5 mm菌饼，接种于含30 mL的绿豆汤培养基中，每瓶5个菌饼，分别于25℃和30℃下，175 r/min振荡培养3 d，血球计数板计数，计算单位体积产孢量，每个温度处理3个重复，以25℃培养为对照，用t测验比较25℃和30℃下产孢量的差异显著性。

1.3.4 高溫胁迫下禾谷镰孢的孢子萌发

将孢子悬浮液浓度调节为5×104个/mL，取200 μL均匀涂布于直径9 cm的水琼脂平板上，分别置于25℃（对照）和30℃下黑暗培养，每个温度处理3次重复，于培养6、8、10、12 h时，在显微镜下观察孢子萌发率，每个重复至少观察100个孢子，当芽管长度超过分生孢子短径一半即为萌发，直至萌发率达90%及以上。

1.3.5 高温下多种胁迫对禾谷镰孢生长的影响

在已活化的菌株菌落边缘打取5 mm菌饼，分别接种到终浓度为1 mol/L NaCl，1 mol/L KCl，0.25 mol/L CaCl2，0.05% 刚果红，0.05% SDS或0.05% H2O2的PDA平板上，以添加等体积无菌水为对照，每处理重复3次，置于25℃（温度对照）和30℃黑暗培养，6 d后，采用十字交叉法测量菌落直径。采用t检验法分别比较同一菌株同一胁迫处理下25℃和30℃下菌落直径的差异显著性，同一菌株相同温度下各胁迫处理与无菌水对照之间的差异显著性。

1.3.6 高温胁迫下禾谷镰孢的致病力测定

致病力测定采用小麦胚芽鞘室内接种法［9］。将‘京双16’用1%次氯酸钠溶液消毒1 min，无菌水冲洗至无味，置于铺有4层滤纸的发芽盒里，种子腹沟朝下，粒与粒之间保持一定间距，盒内保持湿润，盒上盖湿润纱布，转移至人工气候培养箱，25℃，L∥D=12 h∥12 h，培养2～3 d至胚芽鞘长到2～3 cm，选取长势较一致的胚芽鞘置于铺有2层滤纸的 9 cm 培养皿中，每皿10个，并设置2个重复。剪去鞘尖2～3 mm，戴上用浓度为1×106个/mL的孢子悬浮液浸湿的滤纸帽，以无菌水浸湿的滤纸帽接种为对照，培养皿上倒置经紫外线灭菌的500 mL烧杯，封口膜封口，留烧杯嘴供加水和植株呼吸，置于人工气候培养箱，分别于25℃（对照）和30℃，L∥D=12 h∥12 h条件下培养，接种3 d后，去除烧杯和滤纸片，7 d后测量25℃和30℃下培养的胚芽鞘茎基部的褐色病斑长度，用t检验法进行差异显著性分析，并计算30℃下病斑长度和25℃病斑长度的比值（R）。当R>1且30℃和25℃下病斑长度有显著性差异，表明高温下致病力显著增加，当R<1且30℃和25℃下病斑长度有显著性差异，表明高温下致病力显著降低。

1.3.7 高温胁迫下禾谷镰孢的DON毒素产量

将孢子悬浮液接种于20 mL/瓶TBI培养基［10］中，每瓶大约5×104个孢子，于25℃（对照）和30℃黑暗条件下，175 r/min振荡培养7 d，过滤收集滤液于 2 mL 离心管，每处理3个重复，用呕吐毒素（脱氧雪腐镰孢菌烯醇，DON）酶联免疫试剂盒（涿州凯斯科生物技术有限公司）测定滤液中DON毒素含量，t检验法进行差异显著性分析，并计算30℃和25℃下DON含量的比值（R）。当R>1且30℃和25℃下DON含量有显著差异，表明高温下产毒量显著增加，当R<1且30℃和25℃下DON含量有显著性差异，表明高温下产毒量显著降低。

1.3.8 数据分析

数据分析使用R语言采用RGui 4.1.2进行统计分析，选择独立样本t检验法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对禾谷镰孢菌丝生长的影响

供试的9株菌株在25℃和30℃下的菌落直径和抑制率如表1所示，9个菌株在高温下的抑制率分布在21%～34%之间，根据抑制率将9个菌株分为两组，抑制率>30%时归类为温度敏感型菌株，包括菌株Fg47、Fg39、Fg180590和Fg180621;抑制率<30%时，归类为耐高温菌株，包括Fg180664、Fg180663、Fg180680、Fg180730和Fg180673。

2.2 高温胁迫对禾谷镰孢产孢量的影响

温度对禾谷镰孢的产孢量有一定的影响（表2），5株耐高温菌株中，Fg180664和Fg180673在25℃和30℃下产孢量没有显著差异，但是菌株Fg180663、Fg180680、Fg180730在30℃的产孢量显著高于25℃（P<0.05）。而4株温度敏感型菌株中，除了菌株Fg47产孢量在两个温度间没有显著差异外，菌株Fg39、Fg180590、Fg180621在30℃条件下的产孢量显著低于25℃下的产孢量（P<0.05）。综上，温度升高有3株耐高温菌株的产孢量显著增加，3株温度敏感型菌株的产孢量显著降低，表明耐高温菌株可能通过增加产孢量来抵御高温，因此，产孢阶段是耐高温菌株抵御高温的一个关键发育阶段。

2.3 高温胁迫对禾谷镰孢孢子萌发的影响

供试菌株在25℃和30℃下培养，分生孢子萌发率如图1所示，除菌株Fg180664在30℃条件下，培养6 h时孢子萌发率低于25℃培养下的孢子萌发率外，其他8个菌株在30℃条件下，培养6 h的孢子萌发率均高于25℃培养下的孢子萌发率，部分达到显著水平;但是培养至10 h时，除菌株Fg180673和Fg180730外，其余菌株的孢子萌发率在25℃和30℃下一致，均在80%以上，且耐高温菌株与敏感菌株间没有明显差异。以上研究结果表明，30℃高温胁迫能够促进菌株的孢子萌发，但不影响最终孢子的萌发率，且高温胁迫对耐高温菌株和敏感菌株的孢子萌发的影响没有差异。

2.4 高温对禾谷镰孢应答环境胁迫的影响

25℃和30℃下，5株耐高温禾谷镰孢菌株和4株温度敏感型菌株对盐胁迫因子（NaCl、KCl、CaCl2）、细胞壁胁迫因子（刚果红、SDS）及氧化胁迫因子（H2O2）的应答能力测定结果显示，25℃下，所有供试菌株在各盐胁迫因子的胁迫下，菌落直径均显著小于无菌水对照组的直径（P<0.05）;30℃下各盐胁迫因子对所有供试菌株生长的抑制的程度低于25℃，甚至有的菌株菌落直径会超过30℃下无胁迫对照组的直径（表3）。具体而言，在含有NaCl 和CaCl2的培养基上，30℃下各菌株菌落直径与25℃下菌落直径相当，或者大于25℃下菌落直径;而在含有KCl的培养基上，除菌株Fg180664外，所有供试菌株的菌落直径在30℃和25℃条件下并没有显著差异（P>0.05）。30℃下，耐高溫菌株与温度敏感型菌株对盐胁迫的反应没有明显差异（F=3.84，P=0.06）。以上研究结果表明，30℃高温会减轻NaCl和CaCl2胁迫对禾谷镰孢生长的抑制，但是不影响KCl胁迫对禾谷镰孢生长的抑制，表明高温（30℃）下禾谷镰孢对NaCl和CaCl2胁迫有一定的耐受性，但是不同温度敏感型菌株之间没有差异（NaCl： F=3.41，P=0.08;CaCl2： F=0.14，P=0.71）。

在细胞壁胁迫（刚果红和SDS）培养下，不论是在25℃还是30℃下，所有供试菌株的菌落直径均小于同一温度下对照的菌落直径。就同一胁迫而言，所有供试菌株在30℃下的菌落直径也均小于25℃下的菌落直径，且大多差异显著（表4，P<0.05）。30℃下，耐高温菌株与温度敏感型菌株对刚果红和SDS胁迫反应没有明显差异（刚果红：F=0.97，P=0.33;SDS：F=0.83，P=0.37）。表明高温使禾谷镰孢对细胞壁胁迫因子刚果红和SDS更加敏感，但不同温度敏感型菌株之间没有差异。

25℃和30℃下，在含0.05% H2O2的培养基上所有供试菌株的菌落直径均小于同一温度下对照的菌落直径。且在0.05% H2O2胁迫下，所有菌株在30℃下的菌落直径均显著低于25℃（表5，P<0.05）。30℃下，耐高温菌株与温度敏感型菌株对H2O2氧化胁迫反应没有明显差异（F=3.94，P=0.06）。表明，30℃高温使禾谷镰孢对氧化胁迫因子H2O2的胁迫更加敏感，但不同温度敏感型菌株之间没有差异。

2.5 高温胁迫对禾谷镰孢致病力和产DON毒素的影响

禾谷镰孢在25℃和30℃下对小麦胚芽鞘致病力结果如表6所示， 不同禾谷镰孢菌株在不同温度下对小麦胚芽鞘的致病力不同，与25℃相比，30℃高温下5株耐高温菌株处理的小麦胚芽鞘的病斑长度分别表现为增加（Fg180664， P<0.05）、降低（Fg180663和Fg180680，P<0.05）和没有差异（Fg180730和Fg180673），而4株温度敏感型菌株中除菌株Fg180590侵染小麦胚芽鞘引起的病斑长度小于25℃外，菌株Fg47，Fg39和Fg180621的病斑长度均显著长于25℃（P<0.05），且30℃与25℃病斑长度的比值都大于5。以上研究结果表明，大部分耐高温菌株在30℃下致病力不变或降低，而大部分敏感菌株在30℃下致病力反而增加。

供试的9株禾谷镰孢菌株在25℃和30℃条件下产DON毒素量见表6，温度对不同菌株产毒量的影响不同。耐高温菌株Fg180663

在30℃条件下产生的DON毒素量显著低于25℃，而Fg180664、Fg180680和Fg180673在30℃条件下的毒素含量是25℃下的5倍以上；温度敏感型菌株Fg39、Fg180590和Fg180621在30℃条件下的毒素含量仅为25℃下的2倍左右。总体而言，高温（30℃）对大部分菌株的DON毒素的产量有一定促进作用，多数菌株在30℃条件下产生的毒素量显著增加。

综上，高温对禾谷镰孢对小麦胚芽鞘致病力的影响与对DON毒素含量的影响因菌株不同而有差异（表6），对于菌株Fg180664、Fg180663、Fg180730、Fg39和Fg180621，高温对致病力和产毒素量的影响一致，在30℃条件下，其毒素含量增加，对小麦胚芽鞘的致病力也增加;毒素含量降低，致病力也减弱。而菌株Fg180680、Fg180673、Fg47和Fg180590则恰好相反。

3 结论与讨论

温度对病原菌生长、繁殖和致病力都有很大的影响。本研究分析了25℃和30℃对多个禾谷镰孢株的产孢量、孢子萌发速率、胁迫以及致病力和产毒能力等生物学性状方面的影响，结果表明，相对高温（30℃）对于9种禾谷镰孢的菌丝生长均有明显的抑制作用，这与已有的报道和实验室前期研究结果一致，25℃是禾谷镰孢最适生长温度，温度升高菌丝生长速率下降［11］。与之相反，30℃的相对高温对于供试禾谷镰孢菌株的孢子萌发有一定的促进作用，但是不影响最终的孢子萌发率。由于孢子萌发过程是一个能量需求过程，适当的高温能够提供更多的能量，从而使孢子的萌发进程加快。同时，高温促进部分耐高温菌株的产孢量显著增加，降低部分温度敏感型菌株的产孢量，表明产孢阶段是耐高温菌株抵御高温的一个关键发育阶段。

对供试禾谷镰孢菌株的三类胁迫研究表明，相对高温（30℃）使菌株对盐胁迫（NaCl和CaCl2）的耐受能力提高，该研究结果与对酵母的研究结果类似，酵母通过Na+、K+、Ca2+的外流，囊泡中的区隔化、增加质膜对某种离子的吸收来限制其他离子的吸收等来抵御盐胁迫，也可能是温度诱导使酵母对盐胁迫条件产生交叉保护［1112］。

高温对禾谷镰孢的致病力和DON毒素产量都产生了一定的影响，大部分耐高温菌株在30℃下的致病力不变或降低，而大部分敏感菌株在30℃下的致病力反而增加。但是，温度对不同菌株致病力的影响与对DON毒素产生量的影响并不一致。这与已报道的结果吻合，禾谷镰孢的产孢量与致病力没有相关性［1314］。

以上研究结果明确了温度对禾谷镰孢生长、致病力及毒素产生的影响，明确了耐高温菌株可能通过增加产孢量来抵御高温，因此，产孢阶段是耐高温菌株抵御高温的一个关键发育阶段。且部分耐高温菌株在高温下毒素的产生会增加，该研究结果为禾谷镰孢温度适应性规律的研究奠定了基础，对进一步深入认识该菌的温度适应性进化的分子机理，研究气候背景下小麦赤霉病的流行及预测预报和病害防控策略的制定具有重大意义。

参考文献

［1］ MA Zhengqiang， XIE Quan， LI Guoqiang， et al. Germplasms， genetics and genomics for better&nbsp;control of disastrous wheat Fusarium head blight ［J］. Theoretical and Applied Genetics， 2020（S1）： 15411568.

［2］ 马忠华， 陈云， 尹燕妮.小麦赤霉病流行成灾原因分析及防控对策探讨［J］.中国科学基金， 2020， 34（4）： 464469.

［3］ CHEN Yun， KISTLER H C， MA Zhonghua. Fusarium graminearum trichothecene mycotoxins： biosynthesis， regulation， and management ［J］. Annual Review of Phytopathology， 2019， 57（1）： 1539.

［4］ XU Fei， LIU Wei， SONG Yuli， et al. The distribution of Fusarium graminearum and F.asiaticum causing Fusarium head blight of wheat in relation to climate and cropping system ［J］. Plant Disease， 2021， 105（10）： 28302835.

［5］ NIELSEN L K， JENSEN J D， NIELSEN G C， et al. Fusarium head blight of cereals in Denmark： species complex and related mycotoxins ［J］. Phytopathology， 2011， 101（8）： 960969.

［6］ SAREMI H， BURGESS L W. Effect of soil temperature on distribution and population dynamics of Fusarium species ［J］. Journal of Agricultural Science and Technology， 2000（2）： 119125.

［7］ 纪莉景， 栗秋生， 王亚娇， 等. 温度对假禾谷镰刀菌生长、侵染及茎基腐病发生的影响［J］. 植物病理学报， 2020， 50（6）： 723730.

［8］ 赵亚男. 两种小麦赤霉病菌温度敏感性和杀菌剂抗药性研究及防治药剂筛选［D］. 张家口： 河北北方学院， 2020.

［9］ 武爱波. 禾谷镰刀菌 （Fusarium graminearum） 致病力鉴定、毒素检测及其分子生物学研究［D］. 武汉： 华中农业大学， 2005.

［10］种学法. 禾谷镰刀菌类动力GTP酶FgSey1功能研究［D］. 泰安： 山东农业大学， 2020.

［11］ZHANG Xing， ST LEGER R J， FANG Weiguo. Stressinduced pyruvate accumulation contributes to cross protection in a fungus ［J］. Environmental Microbiology， 2018， 20（3）：11581169.

［12］郑聃， 付畅， 戴绍军， 等. 鹽胁迫下酿酒酵母和鲁氏酵母渗透调节方式的对比与分析［J］. 哈尔滨师范大学自然科学学报， 2007（2）： 9195.

［13］李瑞明， 吴继红. 温度对赤霉病菌生长及其致病性的影响［J］. 江西农业科技， 1981（11）： 89.

［14］赵纯森， 马星霞， 武爱波， 等. 禾谷镰孢菌培养性状与致病力的相关性分析［J］. 华中农业大学学报， 2005（3）： 254257.

（责任编辑：杨明丽）