肉桂醛对赤拟谷盗的熏蒸作用及对成虫保护酶活性的影响

王莹莹 邵云飞 杨浩岚 曹付 刘苏 李茂业 李世广

摘要

為明确肉桂醛对赤拟谷盗Tribolium castaneum各发育阶段的杀虫活性及对成虫几种保护酶活性的影响，本试验采用三角瓶密闭熏蒸法测定了肉桂醛对赤拟谷盗低龄幼虫、高龄幼虫、蛹和成虫的熏蒸作用及24 h致死中浓度熏蒸后成虫体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。结果表明，肉桂醛的熏蒸效果与其浓度和赤拟谷盗发育阶段有关，肉桂醛2.5 μL/L熏蒸72 h对赤拟谷盗成虫的熏蒸效果最好，幼虫次之。在24 h致死中浓度处理下，赤拟谷盗成虫体内SOD、POD、CAT活性分别在48、12 h和36 h达到最高，其活性分别为对照的2.70、1.03倍和1.96倍。随着熏蒸时间的延长，成虫POD活性在处理36 h后低于对照，SOD、CAT活性分别在处理36～60 h和24～48 h显著高于对照。综上所述，经肉桂醛熏蒸处理后，赤拟谷盗成虫体内动态平衡受到破坏，进而产生毒害作用。因此，肉桂醛对赤拟谷盗的生物防治有较高的应用价值。

关键词

肉桂醛; 赤拟谷盗; 熏蒸作用; 超氧化物歧化酶; 过氧化物酶; 过氧化氢酶

中图分类号：

S 379.5

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022750

Effects of cinnamaldehyde on fumigation and protective enzyme activity in Tribolium castaneum adults

WANG Yingying#， SHAO Yunfei#， YANG Haolan， CAO Fu， LIU Su， LI Maoye*， LI Shiguang*

（Key Laboratory for Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher 

Education Institutes， College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract

To determine the insecticidal activity of cinnamaldehyde against Tribolium castaneum at various developmental stages and its impact on several protective enzymes in T.castaneum adults， the fumigation effect of cinnamaldehyde on young larvae， old larvae， pupae， and adults were investigated using a conical flask fumigation method， and the activities of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， and catalase （CAT） in the adults exposed to cinnamaldehyde at a median lethal concentration （LC50） were measured. The results showed that the fumigation effect was correlated with the concentration of cinnamaldehyde as well as the developmental stage of T.castaneum. After exposed to 2.5 μL/L of cinnamaldehyde for 72 h， the best fumigation effect was observed on the adults， followed by the larvae. The activities of SOD， POD， and CAT reached the highest level when treated with LC50 （24 h） of cinnamaldehyde for 48， 12 h， and 36 h， respectively; the activities of SOD， POD， and CAT were 2.70， 1.03， and 1.96fold of those in the control group， respectively. The POD activity in treated adults was lower than that in the control group when fumigated for 36 h， while SOD and CAT activities were significantly higher than those in the control group when insects were fumigated in flask for 36-60 h and 24-48 h， respectively. In conclusion， cinnamaldehyde fumigation can destroy the dynamic balance in T.castaneum in vivo， resulting in toxic effects. Therefore， cinnamaldehyde has the potential for biological control of T.castaneum.

Key words

cinnamaldehyde; Tribolium castaneum; fumigation effect; SOD; POD; CAT

赤拟谷盗Tribolium castaneum （Herbst）属鞘翅目Coleoptera 拟步甲科 Tenebrionidae，是重要的储粮害虫之一［1］，在我国至少遍布23个省（区）［2］，为害玉米、水稻、油料等。赤拟谷盗体表臭腺可分泌苯醌等致癌物，严重影响粮食的品质和食用价值，从而造成严重的经济损失［34］。

赤拟谷盗具有食性杂、繁殖力强等特点，化学药剂磷化氢熏蒸是当前控制赤拟谷盗为害的主要方法［5］。由于长时间高剂量地使用化学药剂，赤拟谷盗对化学药剂已产生了不同程度的抗性［6］。随着人们对绿色、无公害食品需求的增加，对赤拟谷盗的防治策略需要逐步转变为以生物防治为核心的综合治理。利用植物精油防治储粮害虫是一种新的绿色防控方法。植物精油具有对人畜安全、易降解、无残留等特点，能够与生物防治相结合，在防治储粮害虫方面具有显著优势。储粮害虫受到植物精油熏蒸处理后其生长发育和繁殖会受到抑制［7］。研究发现丁香、青蒿和啤酒花等植物精油对赤拟谷盗有较好的熏蒸效果［810］。此外，不同植物或者同一植物精油的不同提取方法对害虫的防治效果也会存在显著差异［1112］，因此需研究不同植物精油的杀虫活性，以获取高效、绿色的防控药剂。

肉桂Cinnamomum cassia系樟科樟属中等乔木［1314］，在我国主要种植于广东、云南等地［15］。据报道，肉桂精油对飞蛾幼虫有较好的控制效果，肉桂精油的主要成分为肉桂醛，相对含量为83.18%［16］。Kordali等［17］的研究发现肉桂醛对谷象Sitophilus granarius有良好的杀虫活性。然而，肉桂醛对赤拟谷盗的杀虫活性及对其生理生化的影响仍知之甚少。

昆虫体内存在保护酶、解毒酶等多种酶，在维持机体自由基代谢及各项生理活动中具有重要作用［1819］，其中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是较为重要的3种保护酶。贾变桃等［20］报道了虱螨脲对小菜蛾Plutella xylostella体内保护酶活性的影响。马新耀等［21］研究了朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus 5日龄雌成螨经不同剂量的艾蒿精油处理后体内保护酶活性的变化。因此，保护酶活性的变化可作为选择处理条件的重要指标。当前，关于赤拟谷盗成虫在肉桂醛处理后的生物活性及体内的保护酶调控机制还鲜有报道。基于此，本研究测定了肉桂醛对赤拟谷盗不同虫态的熏蒸作用及成虫体内的保护酶活性变化，以期为科学合理使用肉桂醛防治赤拟谷盗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源

试验所用赤拟谷盗为安徽农业大学植物病虫害生物学与绿色防控实验室饲养种群。将小麦粉和酵母粉按10∶1（m/m）比例混匀装入罐头瓶中，接入赤擬谷盗成虫，置于温度（27±1）℃，相对湿度（75±5）%的人工气候箱中24 h黑暗饲养。将孵化后3 d和7 d分别设定为低龄幼虫和高龄幼虫;供试成虫为羽化7 d活性较好的成虫。

1.1.2 药剂及试剂

98%肉桂醛购于江西雪松天然药用油有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 肉桂醛熏蒸活性测定

参照杨杉等［22］的方法测定肉桂醛对赤拟谷盗的熏蒸活性。将赤拟谷盗低龄幼虫、高龄幼虫、蛹和成虫放入灭菌的250 mL三角瓶中。将98%肉桂醛滴于1 cm×6 cm的长方形滤纸片上，并快速将滤纸片悬垂于距三角瓶底部2～3 cm高处，密封瓶口。98%肉桂醛的熏蒸浓度（药剂体积/容器体积）设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μL/L，熏蒸时间分别设置为24、48、72 h。每浓度每处理时间设3次重复，每重复30头。以空白滤纸为对照。熏蒸在温度（27±1）℃，24 h黑暗的人工气候箱中进行。熏蒸结束后检查并记录赤拟谷盗死亡数，计算死亡率。死亡标准为用毛笔拨动虫体，若无反应，则认为试虫已死亡。 

死亡率=（死亡虫数/总虫数）×100%;

校正死亡率=［（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）］×100%。

1.3 酶活性测定

1.3.1 酶液的制备

根据1.2不同浓度熏蒸活性测定结果，选择24 h的LC50研究肉桂醛对赤拟谷盗成虫保护酶活性的影响，以无药剂熏蒸处理作为对照，熏蒸时间分别设置为12、24、36、48、60 h，熏蒸方法同1.2。每处理3次重复。选取熏蒸后存活的赤拟谷盗成虫 （0.1 g），将成虫转移到玻璃匀浆器并加入1 mL的10 mmol/L PBS缓冲液进行研磨，研磨期间玻璃匀浆器一直处于冰中保持低温。将样本组织匀浆液离心，取上清液即为待测酶液，置于－20℃的冰箱中储藏备用。

1.3.2 蛋白质含量的测定

配制BSA标准品和BCA工作液，按照总蛋白（BCA）测定试剂盒说明书操作进行。设置波长为580 nm，用酶标仪测定各孔的吸光度。每孔测定3次，每样重复3次。

1.3.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O-2），O-2可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560 nm处有吸收;SOD可清除O-2，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。取待测酶液，按照SOD试剂盒说明书进行操作，测定560 nm处各孔的吸光度，代入公式计算SOD的活性，活性单位为U/mg。抑制百分率=（空白孔的吸光度－处理孔的吸光度）/空白孔的吸光度×100%;样本中SOD活性=11.11×抑制百分率/（1-抑制百分率）×样品稀释倍数。

1.3.4 过氧化物酶（POD）活性的测定

POD在有过氧化氢存在的情况下，能使愈创木酚发生氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm有最大光吸收。取待测酶液，按照POD试剂盒说明书操作，记录470 nm下30 s时的吸光度A1和90 s后的吸光度A2。代入公式计算POD活性，活性单位为U/mg。样本中POD活性=9 800×（A2A1）/蛋白稀釋倍数。

1.3.5 过氧化氢酶（CAT）活性的测定

H2O2在240 nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240 nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。取待测酶液，按照CAT试剂盒说明书操作。测定240 nm下各孔的吸光度为A1，1 min后测定吸光度为A2。代入公式计算CAT活性，活性单位为U/mg。样本中CAT活性=764.5×（A1A2）/蛋白稀释倍数。

1.4 数据处理

用 WPS Office 2019 软件初步整理数据并计算校正死亡率。使用 DPS 7.05软件计算校正死亡率、卡方（χ2）、致死中浓度（LC50）等，并采用Duncan氏新复极差法比较同一时间不同处理浓度下在5%水平上的差异显著性，Student’s t检验两个样本之间在5%水平上的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 肉桂醛对赤拟谷盗的熏蒸作用

由表1可知，随着肉桂醛浓度的增加，低龄幼虫、高龄幼虫、蛹和成虫的校正死亡率均逐渐升高，在同一浓度下，校正死亡率随处理时间的延长而增加。以2.5 μL/L处理试虫72 h，低龄幼虫、高龄幼虫、蛹和成虫的死亡率分别为63.35%、45.55%、39.98%和91.84%。

由表2可知，随处理时间的增加，肉桂醛对赤拟谷盗成虫的熏蒸毒力增强。其对赤拟谷盗成虫24、48、72 h的LC50分别为2.28、1.73、1.28 μL/L。

2.2 肉桂醛对赤拟谷盗成虫保护酶活性的影响

采用肉桂醛对赤拟谷盗成虫24 h致死中浓度进行不同时间的熏蒸处理，处理后赤拟谷盗成虫体内SOD、POD和CAT活性变化见图1。如图1a所示，熏蒸36～48 h，SOD活性显著高于对照，并在48 h达到最大，随后降低，但也显著高于对照组（P＜0.05）。表明肉桂醛对赤拟谷盗成虫体内SOD活性有明显诱导作用。

如图1b 所示，熏蒸12 h和24 h，POD活性与对照组无显著差异。熏蒸36～60 h，POD活性持续显著下降（P＜0.05），在60 h时POD活性降到最低，为对照组的45%。

如图1c 所示，熏蒸24～48 h，CAT活性显著高于对照（P＜0.05），其中，熏蒸36 h和48 h的CAT活性分别为对照的1.96和1.85倍。熏蒸60 h CAT活性与对照组相比无显著差异。

3 结论与讨论

肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分，存在于肉桂、风信子、玫瑰等植物精油中［23］。黄聪灵［24］的研究表明，肉桂醛对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela 2龄幼虫有较好的熏蒸作用，死亡率随浓度升高而增加。不同精油对不同发育阶段的赤拟谷盗有不同的作用。侯志波等［25］的研究表明，鸡骨柴挥发油对各发育阶段的赤拟谷盗均具有熏蒸作用，且对成虫的熏蒸活性高于幼虫。张元臣等［26］研究报道，赤拟谷盗幼虫和蛹受到北艾精油熏蒸后，幼虫的死亡率高于蛹的死亡率。本研究中，肉桂醛对赤拟谷盗的熏蒸效果表现为成虫优于幼虫，对蛹的熏蒸效果最差。肉桂醛在害虫的防控方面具有开发潜力。本文为害虫绿色防控提供新的数据。

SOD、POD和CAT是昆虫体内重要的保护酶。正常情况下，细胞内的自由基在3种酶的协同作用下处于一种动态平衡，但在不利环境下昆虫体内酶系统的动态平衡受到破坏，对虫体产生毒害，最终可能导致昆虫死亡［27］。陆驰宇［28］研究表明，赤拟谷盗成虫经八角茴香油熏蒸后，其体内CAT活性随处理时间延长呈现先上升后下降趋势，但总体高于对照，POD活力随处理时间的延长表现为先激活后抑制作用。本研究中赤拟谷盗成虫用肉桂醛24 h的LC50处理不同时间，CAT活性在24～48 h活性仍显著高于对照组，POD活力则逐渐下降且最终低于对照组。程作慧等［29］研究报道，迷迭香处理对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus体内的SOD活性有激活作用。本研究也表明熏蒸处理导致赤拟谷盗成虫体内的SOD活性升高，并在48 h达到最高，随后开始下降，但仍显著高于对照。总体来说，本试验结果与上述报道基本一致，原因可能是肉桂醛熏蒸处理赤拟谷盗成虫后，虫体内动态平衡被打破，产生应激反应。但熏蒸时间不同对不同保护酶的影响也不同，可能是试虫在不同环境下采取的一种生存对策。

本试验结果显示，肉桂醛对成虫的熏蒸效果最好，并且显著影响成虫体内3种保护酶的活性。肉桂醛作为肉桂精油的主要成分［30］，其与其他精油或植物源农药协同增效还需进一步研究。本课题组今后也将继续探究肉桂醛对赤拟谷盗成虫的作用机理，为进一步开发利用新型的植物源农药，实现储粮害虫的绿色防控奠定可行的理论基础。

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