赫氏真厚螺的检疫鉴定

王沛 胡美玲 姜娇 张卫红 陈宇 林金成 林阳武 周卫川

摘要

赫氏真厚螺Euhadra herklotsi是一种重要的园艺有害生物。本文采用贝壳形态、生殖系统解剖和分子生物学相结合的方法对福建口岸截获的一种蜗牛进行检疫鉴定，结果表明，该蜗牛为赫氏真厚螺，并与近似种的形态鉴别特征进行了比较，讨论了蜗牛序列比对鉴定方法的适用性，为国境口岸防御该蜗牛的入侵提供了科学依据。

关键词

赫氏真厚螺; 贝壳形态; 生殖系统解剖; 分子特征; 植物检疫

中图分类号：

S 41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022726

Quarantine and identification of Euhadra herklotsi

WANG Pei1，2， HU Meiling1，2， JIANG Jiao3， ZHANG Weihong4， CHEN Yu1，2， LIN Jincheng5，

LIN Yangwu1， ZHOU Weichuan1，2*

（1. Technology Center of Fuzhou Customs District， Fuzhou 350001， China; 2. Fujian Key Laboratory of 

Inspection and Quarantine Technology Reserach， Fuzhou 350001， China; 3. Zhejiang Natural Nature Museum， 

Hangzhou 310014， China; 4. College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830000， 

China; 5. Fuzhou Customs District， Fuzhou 350015， China）

Abstract

Euhadra herklotsi is an important horticultural pest. In this paper， a snail intercepted at Fujian port was quarantined and identified by the methods of shell morphology， reproductive system anatomy and molecular biology. The results showed that the snail was E.herklotsi， and the morphological identification characteristics among E.herklotsi and its sibling species were compared. In addition， the applicability of the sequence alignment identification method was discussed. This paper provided scientific basis for preventing the invasion of this snail at the border port.

Key words

Euhadra herklotsi; shell morphology; reproductive system anatomy; molecular characteristic; plant quarantine

赫氏真厚螺Euhadra herklotsi （Martens， 1861）隸属于软体动物门Mollusca，腹足纲Gastropoda，柄眼目Stylommatophora，巴蜗牛科Bradybaenidae，真厚螺属Euhadra［1］，是国际植物检疫中备受关注的一种危险性有害生物。该蜗牛主要分布于日本和韩国，不但严重为害各种蔬菜、瓜果、花卉和农作物，为农业生产上的重要有害生物，而且是许多人畜共患寄生虫的中间宿主，影响人畜健康［25］。此外，该螺爬行后可留下银灰色的黏液痕迹，严重降低水果蔬菜等作物的商品价值，影响居民区和风景区的环境卫生。

赫氏真厚螺常生活在山区、丘陵地带潮湿的灌木丛、草丛、石块或落叶下，喜食植物多汁的嫩叶及嫩芽部分［24］，故对园艺作物危害最大。该蜗牛昼伏夜出，常藏匿于阴暗潮湿处，通常以休眠方式随货物和木质包装材料远距离传播。2016年福建口岸从日本进境旅客携带物中首次截获赫氏真厚螺，该蜗牛在中国大陆尚无分布记录［67］，因此必须加强检疫，严防其入侵和为害。目前真厚螺属的分类与鉴定仍以贝壳形态为主，但贝壳形态常因地理环境的变化而变异，对一些贝壳特征不典型的标本容易造成误定［89］。本文采用贝壳形态、软体解剖和分子生物学相结合的方法研究了该蜗牛的鉴定技术，并与近似种的形态鉴别特征进行了比较，讨论了蜗牛序列比对鉴定方法的适用性，主要结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2016年福建口岸从日本进境旅客携带物中截获的蜗牛12只，其中4只活体标本先按照《软体动物常规检疫规范（SN/T 30672011）》［10］中方法进行灭活和脱水处理，然后-40℃冷冻保存备用。空壳标本洗净烘干后常温保存。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

用电子游标卡尺测量成螺贝壳的壳高和壳宽，精度为0.1 mm。用放大镜观察贝壳的形态特征，生殖系统解剖在体视显微镜（ZEISS Stemi 2000）下操作，根据检验检疫行业标准《软体动物常规检疫规范（SN/T 30672011）》［10］和Dillon［11］的报道进行贝壳形态的观察、测量和描述。按照Gómez［12］的方法进行生殖系统的解剖、绘图和描述。

用单反相机（CANON 550D），分别拍摄贝壳标本的正侧面、背面和腹面，以电子影像文件储存。

1.2.2 分子生物学鉴定

1.2.2.1 基因组DNA提取及PCR扩增

取赫氏真厚螺腹足肌肉0.02 g，按照天根生化科技（北京）有限公司的TIANamp Genomic DNA提取試剂盒说明书提取基因组总DNA。利用线粒体COⅠ基因通用引物（LCO1490： 5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′; HCO2198： 5′

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）进行PCR扩增［13］。

PCR反应体系：DNA模板（100 ng/μL）2 μL， LCO1490（10 μmol/L）和 HCO2198（10 μmol/L）各0.5 μL，2×Master Mix 10 μL，用超纯水定容至 20 μL。PCR反应程序为：94℃预变性 5 min;94℃ 变性 50 s，45℃退火 30 s，72℃延伸 50 s，30 个循环;72℃延伸 10 min;4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目标片段送生工生物工程（上海）有限公司进行双向测序。

1.2.2.2 序列拼接与比对

将双向测序结果用序列分析软件 BioEdit V.7.0［14］进行序列的拼接和人工校对，并与GenBank已公布的赫氏真厚螺的 COⅠ基因序列进行比对。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 贝壳形态

材料检查：来自日本南部，成螺活体4个（QRB75～QRB78），空壳8个，其中成螺6个（QRB79～QRB84），幼螺2个（QRB85～QRB86）。

测量结果：成螺，壳高11.5～25.0 mm， 壳宽20.5～36.1 mm。

贝壳形态：贝壳大，壳质厚，坚实，呈矮圆锥形。有5～6个螺层，前几个螺层缓慢增长，略膨胀，螺旋部低矮。体螺层近圆形，膨大，其高度约为壳高的2/3，在壳口处向右下方倾斜。壳顶钝，缝合线深。壳面颜色多变，乳白色、浅黄色、紫褐色，有稠密而较粗的生长线和刻纹。体螺层周缘有一条螺旋状的紫褐色条带，并向螺旋部延伸，逐渐靠近缝合线，最终与缝合线完全重叠。壳口马蹄形，向下倾斜。口唇外折，厚，浅紫色。轴唇在脐孔处略外折，内唇贴覆于体螺层上，形成稍厚的胼胝部。脐孔大而深，呈洞穴状，周围紫褐色。

图1 赫氏真厚螺贝壳形态

Fig.1 Shell morphology of Euhadra herklotsi

2.1.2 生殖系统

在蜡盘上解剖软体并分离出生殖系统后，按Gómez［12］的方法将生殖系统特征描述如下：矢囊大，副矢囊中等大小，似长柱形。黏液腺约13枝，呈放射状排列。受精囊椭圆形，受精囊柄长。输卵管中等粗细。输精管细，长度约为输卵管的2.5倍。鞭状体末端细小。阴茎牵引肌略粗，短。阴茎长，中等粗细。本文描述的生殖系统特征（图2）与前人的记述基本一致［4］，但后者没将黏液腺进行分离和统计。

图2 赫氏真厚螺生殖系统

Fig.2 Reproductive system of Euhadra herklotsi

2.2 分子生物学鉴定

活体标本（实验室冷冻标本编号：QRB75），经DNA提取、PCR扩增、双向测序、序列拼接和人工校对后，得到682 bp长度序列，经与GenBank已发表的赫氏真厚螺（登录号：AB852699.1）线粒体COⅠ基因片段序列（533 bp）比对，覆盖率为100%，序列一致性为97.75%。根据已有的陆生软体动物分子系统学文献分析，有的物种同源性大于98%才确认为同种［1517］，也有的学者认为同源性大于94%即可认为是同一物种［18］，这与某些学者描述的其他动物一致性大于98%可认为是同种差别较大［1920］，不同的物种判定标准不同。对于陆生软体动物可能的原因是移动能力弱，容易形成地理种群隔离，种群间的基因交流远不及飞翔的昆虫等动物［2122］。

3 结论和讨论

赫氏真厚螺在日本和韩国广泛分布，本文对其进行了贝壳形态、软体解剖和分子生物学研究，以期为相关人员提供鉴定技术资料。该蜗牛可随苗木、花卉、运输工具、木质包装材料、未经加工的其他植物性材料等远距离传播。我国迄今为止尚无该蜗牛分布，但从该蜗牛目前分布的纬度来看，我国大部分地区的生态环境和气候条件适合该蜗牛生栖繁殖，且其为杂食性，寄主广泛。因此，建议有关部门加强对其检疫，警惕其传入国内。

赫氏真厚螺、阿玛丽真厚螺E.amaliae 和亚颏真厚螺E.subnimbosa都是右旋真厚螺，形态上较为相似，且在日本均有分布［1，6］，容易误定。三者的主要鉴别特征列于表1，供检疫鉴定时参考。

在具体的检疫实践中，往往难以获得典型的标本，如送鉴的标本为幼螺或不成熟时，形态鉴定就十分困难，由于检测周期的限制，饲养为成螺再鉴定则

更不可能［23］，成螺贝壳也会因环境影响而形成不典型的贝壳特征，需要用其他鉴定方法进行辅助鉴定［2122］。本文测定的COⅠ序列为赫氏真厚螺的分子比对鉴定提供了新的技术方法，PCR技术在国境口岸基层检验检疫部门已经普及，该项技术以生物基因组DNA序列比对为基本依据，具有检测周期短、特异性强、灵敏度高等特点。目前，无脊椎动物已有公认的线粒体COⅠ基因通用引物，技术成熟，受检测目标的形态变异、成熟度等方面影响较小［24］，特别适合于卵粒、幼螺等不具备形态鉴定条件样品的快速检测鉴定。

参考文献

［1］ MARTENS E. Die japanesischen binnenschnecken im leidner museum ［J］. Malakozoologische Bltter， 1861， 7： 3261.

［2］ 黑田德米， 波部忠重. 贝类研究农书第1辑： 蜗牛总科［M］. 东京： 三明社， 1949.

［3］ 日本环境省自然保护局. 生物多样性调查： 动物分布调查报告书（下）—陆产与淡水贝类［M］. 东京： 日本生物多样性中心出版， 2002.

［4］ NISHI H， SOTA T. Geographical divergence in the Japanese land snail Euhadra herklotsi inferred from its molecular phylogeny and genital characters ［J］. Zoological Science， 2007， 24（5）： 475485.

［5］ 周衛川， 余书生， 陈德牛， 等. 广州管圆线虫中间宿主—软体动物概述［J］. 中国人兽共患病学报， 2007， 23（4）： 401408.

［6］ 陈德牛， 高家祥. 中国经济动物志：陆生软体动物［M］. 北京： 科学出版社， 1987.

［7］ 钱周兴， 周卫川. 中国常见陆生贝类图鉴［M］. 浙江：浙江人民美术出版社， 2014.

［8］ AZUMA M. Colored illustrations of the land snails of Japan ［M］. Osaka： Hoikusha， 1995.

［9］ SCHILEYKO A A. Treatise on recent terrestrial pulmonate molluscs. Part 12. Bradybaenidae， Monadeniidae， Xanthonychidae， Epiphragmophoridae， Helminthoglyptidae， Elonidae， Humboldtianidae， Sphincterochilidae， Cochlicellidae ［J］. Ruthenica， 2004， 2（12）： 16271763.

［10］中華人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 软体动物常规检疫规范： SN/T 30672011 ［S］. 北京： 中国标准出版社， 2011.

［11］DILLON R T. What shall I measure on my snails？ Allozyme data and multivariate analysis used to reduce the nongenetic component of morphological variance in Goniobasis proxima ［J］. Malacologia， 1984， 25： 503511.

［12］GMEZ B J. Structure and functioning of the reproductive system ［M］∥BAKER G M. The biology of terrestrial molluscs. Oxon： CABI Publishing， 2001.

［13］FOLMER O， BLACK M， HOEH W， et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates ［J］. Molecular Marine Biology and Biotechnology， 1994， 3（5）： 294299.

［14］HALL T A. BioEdit： a userfriendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT∥Nucleic Acids Symposium Series ［M］. USA： Oxford University Press， 1999.