对铜绿丽金龟具有高致病力的昆虫病原线虫的筛选

白勇章 王文杰 王志敏 李朔涵 李克斌 曹雅忠 王森山 宋丽雯 尹姣

摘要

為筛选对铜绿丽金龟Anomala corpulenta幼虫具有生防潜力的昆虫病原线虫品系，测定了9个昆虫病原线虫品系对铜绿丽金龟1 龄幼虫的致病力，以及不同施用剂量、环境温度及土壤相对湿度条件对线虫致病力的影响。生测结果表明，樱桃异小杆线虫品系Heterorhabditis beicherriana D266对铜绿丽金龟幼虫致病力最高，处理11 d后的校正死亡率达到了98.3%;对线虫D266致病力的单因子测定发现，侵染铜绿丽金龟幼虫的最佳剂量为150 IJs/头、最佳温度范围为20～30℃、最佳土壤湿度为18%，有较好的开发应用潜力。

关键词

铜绿丽金龟; 昆虫病原线虫; Heterorhabditis beicherriana; 致病力

中图分类号：

S 476

文献标识码： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022805

Screening of entomopathogenic nematodes with high virulence to Anomala corpulenta

BAI Yongzhang1，2#， WANG Wenjie2#， WANG Zhimin2， LI Suohan2， LI Kebin2， CAO Yazhong2，WANG Senshan1， SONG Liwen1*， YIN Jiao2*

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China; 2. State Key Laboratory 

for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural 

Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

In order to screen the strains of entomopathogenic nematodes that have effective biocontrol potential against Anomala corpulenta larvae， the virulence of nine entomopathogenic nematodes strains against the 1st instar of A.corpulenta was determined and the effects of nematodes under different infection doses， ambient temperature and soil humidity were measured. The results showed that Heterorhabditis beicherriana D266 had the highest virulence against the A.corpulenta， and the corrected mortality reached 98.3% on the 11th day after infection. The single factor determination of the virulence of nematode D266 showed that the best optimal dose， temperature and soil humidity of infecting A.corpulenta larvae were 150 IJs/individual， 20-30℃ and 18%， respectively. H.beicherriana D266 has a good potential for beetle pests controlling.

Key words

Anomala corpulenta; entomopathogenic nematode; Heterorhabditis beicherriana; virulence

铜绿丽金龟Anomala corpulenta Motschulsky属鞘翅目Coleoptera，丽金龟科Rutelidae，其幼虫俗称蛴螬，寄主范围广，为害隐蔽，且为害时间长，是我国地下害虫的优势种群之一［15］。铜绿丽金龟成虫以多种果树、林木、麻类和农作物的叶片为食;幼虫主要为害植物的地下根茎及荚果，严重时导致植物枯萎死亡［6］。近年来，由于高毒农药的禁用、害虫抗药性的产生及耕作制度的变化，导致蛴螬为害程度加重［711］。因此，生产中迫切需要对蛴螬的高效、绿色防控技术［1214］。

昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes，EPN）具有主动搜索寄主、杀虫范围广、杀虫能力强、对人畜和环境安全以及规模化生产相对简单等优点，是一种新型的高效生物杀虫剂，尤其适用于地下害虫，在蛴螬生物防治研究中备受关注［1516］。目前国内外对昆虫病原线虫防控地下害虫开展了大量的研究工作，如用Steinernema longicaudum X7 和Heterorhabditis bacteriophora H06两种线虫防治花生地蛴螬，防治田花生可增产70%［17］。H.bacteriophora沧州品系对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的致病力达到93.3%［18］。尽管昆虫病原线虫防治蛴螬成效显著，但其防治效果受线虫种类、施用剂量、环境温度和土壤湿度等因素影响［19］。因此，充分了解昆虫病原线虫的生物学特性，是蛴螬防治成功的重要条件。

本研究通过室内生物测定9种（品系）昆虫病原线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力，筛选出对铜绿丽金龟幼虫具有高致病力的昆虫病原线虫品系，并确定该线虫在不同条件下的致病力，以期为铜绿丽金龟的生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试线虫与昆虫

供试昆虫病原线虫：樱桃异小杆线虫Heterorhabditis beicherriana（简写为H2，下同）、H.beicherriana D266品系（D266）、H.beicherriana LF品系（LF）、印度异小杆线虫H.indica（H1）、拟双角斯氏线虫Steinernema ceratophorum（XH4）、斯氏线虫Steinernema sp. YNb33 D715（D715）、芜菁夜蛾斯氏线虫S.feltiae SFSN （SFSN）、小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsae ALL（ScALL）和长尾斯氏线虫S.longicaudum（S2）共9种（品系）昆虫病原线虫，其中H.beicherriana（H2）、H.indica（H1）、S.longicaudum（S2）由南开大学提供，其他均由中国农业科学院植物保护研究所地下害虫实验室提供。试验所用昆虫病原线虫均为大蜡螟Galleria mellonella活體扩繁而获得的最新侵染期线虫（infective juveniles，IJs）。

供试昆虫：2021年从河北廊坊田间采集铜绿丽金龟成虫，在塑料养虫箱（70 cm×50 cm×50 cm）中集中饲养，每箱200头，土壤厚30 cm左右，相对湿度18%～20%、温度（25±1）℃、饲喂新鲜榆树叶片，待其产卵后，每隔3 d分批将待孵化卵挑出，放在相对湿度18%～20%土中孵化，幼虫饲喂萌芽的小麦种子和玉米种子，待幼虫长到10～12 日龄（1龄）后备用。

1.2 不同昆虫病原线虫对铜绿丽金龟幼虫致病力的测定

选取10～12日龄铜绿丽金龟幼虫为供试昆虫，测定不同昆虫病原线虫对其的致病力。在六孔板各孔内放入1粒萌发的玉米种子，每孔接入10～12日龄健康、个体均匀的幼虫1头，覆盖相对湿度约18%～20%的无菌土（过40目筛，20 g）;将线虫浓度配制成1 000 IJs/mL，每孔加入200 μL线虫悬浮液，盖上盖子;每个处理30头供试昆虫，在品系筛选试验中，以LF作为阳性对照，剂量为200 IJs/头，以滴加200 μL无菌水作为阴性对照，将各处理置于同一人工气候箱中，温度为（25±1）℃、相对湿度为70%～80%。处理后3、5、7、9 d和11 d分别统计幼虫死亡数并计算校正死亡率，试验设3次重复。

1.3 剂量对D266侵染铜绿丽金龟幼虫能力的影响

将线虫D266配制成250、375、500、625、750 IJs/mL 和1 000 IJs/mL 6个浓度，每孔加入200 μL线虫悬浮液，即6个处理的线虫剂量分别为50、75、100、125、150 IJs/头和200 IJs/头，同时以滴加200 μL无菌水作为对照。其他试验条件、观察记录方法同1.2。

1.4 温度对D266侵染铜绿丽金龟幼虫能力的影响

D266线虫剂量150 IJs/头，在10、15、20、25、30℃和35℃共6个不同温度条件下处理铜绿丽金龟幼虫，同时以滴加相同剂量无菌水作为对照，将各处理置于相应温度人工气候箱中。其他试验条件、观察记录方法同1.2。

1.5 土壤湿度对D266侵染铜绿丽金龟幼虫能力的影响

D266线虫剂量为150 IJs/头，用无菌水和200 μL线虫（750 IJs/mL）配制3%、8%、13%、18%和23% 5个土壤湿度梯度;六孔板用保鲜膜覆盖后，再用镊子扎1个小孔以保证一定的空气流通，同时以滴加相同剂量无菌水作为对照，将各处理置于相应湿度人工气候箱中。其他试验条件、观察记录方法同1.2。

1.6 数据统计分析

试验中昆虫病原线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力均用校正死亡率表示。先对百分数进行反正弦转换，然后对不同处理进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），用Duncan氏新复极差法进行显著性分析。数据分析均在Excel 2010 与SPSS 19.0 统计分析软件上完成。

校正死亡率＝（处理组死亡率－对照组死亡率）/（1－对照组死亡率）×100%。

2 结果与分析

2.1 不同昆虫病原线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力

不同昆虫病原线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力结果如表1。随着线虫处理时间的增加，幼虫校正死亡率逐渐增大，其中D266品系处理铜绿丽金龟幼虫11 d后的校正死亡率达到最高（98.3%）;且不同昆蟲病原线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力差异较大，在侵染后的前7 d，D266、H2和LF等3个品系间的校正死亡率无显著差异，而显著高于其他线虫品系;侵染后的9～11 d，D266与H2的校正死亡率产生了显著差异，但与LF的校正死亡率差异不显著，其中D266处理铜绿丽金龟幼虫的校正死亡率最高（98.3%），XH4处理幼虫的校正死亡率最低（33.9%），显著低于其他线虫处理。因此，后续试验线虫品系均选用D266。

2.2 不同施用剂量的D266对铜绿丽金龟幼虫的致病力

在相同的温度和土壤湿度条件下，不同施用剂量的D266对铜绿丽金龟幼虫的致病力结果如表2。相同处理时间下，随着线虫剂量的增加，幼虫校正死亡率呈上升趋势。150、200 IJs/头剂量处理铜绿丽金龟幼虫11 d后的校正死亡率均达到95%以上，在整个观察期间，相同处理时间下，150、200 IJs/头剂量处理铜绿丽金龟幼虫校正死亡率显著高于其他剂量处理，但两者之间无显著差异;处理11 d后，50 IJs/头剂量处理铜绿丽金龟幼虫校正死亡率最低（56.7%），而显著低于除75 IJs/头剂量（65.0%）外的其他剂量处理。因此，后续试验均采用最适的线虫剂量 150 IJs/头侵染幼虫。

2.3 D266在不同温度下对铜绿丽金龟幼虫的致病力

研究结果（表3）表明，当温度为10℃和35℃时，线虫处理11 d后的校正死亡率分别为36.7%和41.2%，显著低于其他温度处理;当温度为20～30℃时，线虫处理11 d后校正死亡率可达80%以上，其中，25℃时校正死亡率显著高于其他温度处理，但与20℃无显著差异，同时20℃和30℃时校正死亡率也无显著差异。由此可知，温度会显著影响昆虫病原线虫的致病力，昆虫病原线虫D266侵染铜绿丽金龟幼虫的适宜温度范围为20～30℃。

2.4 D266在不同土壤湿度下对铜绿丽金龟幼虫的致病力

表4结果表明，当土壤湿度为18%时，线虫处理3、5、7、9、11 d后幼虫校正死亡率均显著高于其他处理;土壤湿度为3%时，处理11 d后校正死亡率仅为32.1%，显著低于其他处理，土壤湿度为13%时校正死亡率为78.4%，仅显著低于18%的土壤湿度处理。8%与23%的土壤湿度处理3～11 d后，

无显著差异。综上所述，土壤湿度过低或过高均会显著影响该线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力，D266侵染铜绿丽金龟幼虫的最佳土壤湿度为18%。

3 结论与讨论

本研究结果表明，供试的9种昆虫病原线虫品系对铜绿丽金龟幼虫的致病力存在着差异性，其中樱桃异小杆线虫D266、LF和H2对铜绿丽金龟幼虫的致病力较高，其校正死亡率分别为98.3%、94.7%和84.7%。李根等［20］测定了5种不同昆虫病原线虫对小地老虎Agrotis ipsilon 3龄幼虫的致病力，筛选出小卷蛾斯氏线虫ScAll对小地老虎的致病力最强，处理72 h后校正死亡率达到86.7%;梁铭荣等［21］测定小卷蛾斯氏线虫ScAll和芜菁夜蛾斯氏线虫SFSN处理草地贪夜蛾2龄幼虫36 h后死亡率分别为92%和88%;李而涛等［2223］室内生测樱桃异小杆线虫LF处理华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita 1龄幼虫7 d后校正死亡率达100%，处理暗黑鳃金龟H.parallela 1龄幼虫9 d后校正死亡率达100%;樱桃异小杆线虫D266处理暗黑鳃金龟幼虫11 d后校正死亡率达100%［24］。由此可见，不同昆虫病原线虫品系对不同昆虫的致病力不同，筛选出致病力强的昆虫病原线虫品系是防治害虫的关键。

不同剂量樱桃异小杆线虫D266对铜绿丽金龟幼虫的致病力结果说明，在相同的处理时间下，幼虫校正死亡率随线虫施用剂量的增加而升高，200 IJs/头施用剂量与50 IJs/头施用剂量对幼虫校正死亡率相差一倍。杨淋凯等［25］的研究表明，在芜菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae 0663PG和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫数量比为160∶1时，对草地贪夜蛾幼虫的致死率达到100%。小卷蛾斯氏线虫和嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora 在4 000 IJs/mL剂量下对云斑天牛Batocera lineolata幼虫的校正防效分别达93.8%和82.4%［26］。因此，在生产应用中，选择最佳的线虫施用剂量不仅能得到理想的控制效果，而且可以降低防治成本［2728］。

环境温、湿度也是影响昆虫病原线虫侵染寄主能力的重要因素［2930］。昆虫病原线虫适宜的侵染温度是25℃左右［3136］，这与本研究结果樱桃异小杆线虫D266侵染铜绿丽金龟幼虫的适宜温度范围为20～30℃一致。湿度过低或过高均会显著影响线虫对铜绿丽金龟幼虫的致病力，如11%～20%的土壤湿度为嗜菌异小杆线虫沧州品系的适宜侵染湿度［37］，本研究中昆虫病原线虫D266侵染铜绿丽金龟幼虫的最佳土壤湿度为18%。

本研究从9种昆虫病原线虫品系中初步筛选得出樱桃异小杆线虫D266线虫品系对铜绿丽金龟1龄（10～12日龄）幼虫最佳施用剂量为150 IJs/头，最佳侵染温度范围为20～30℃，最佳土壤湿度为18%。该研究结果可为后续利用樱桃异小杆线虫生防制剂防治铜绿丽金龟提供理论参考依据。

参考文献

［1］ 郭予元， 吴孔明， 陈万权. 中国农作物病虫害：中册［M］. 3版. 北京： 中国农业出版社， 2015： 14991501.

［2］ 魏鸿钧， 张治良， 王荫长. 中国地下害虫［M］. 上海： 上海科學技术出版社， 1989： 98104.

［3］ 赵莹， 成巨龙， 袁治理， 等. 陕西烟田地下害虫种类初步调查［J］. 中国烟草科学， 2014， 35（3）： 4145.

［4］ 刘福顺， 冯晓洁， 刘春琴， 等. 河北沧州花生田蛴螬发生动态及影响因素分析［J］. 中国植保导刊， 2022， 42（4）： 3337.

［5］ 宫庆涛， 武海斌， 姜莉莉， 等. 铜绿丽金龟生物学特性及防控技术［J］. 落叶果树， 2019， 51（2）： 3739.

［6］ 周文智. 铜绿丽金龟发生规律及防治效果试验研究［J］. 现代农村科技， 2018 （7）： 7172.

［7］ 罗宗秀， 李克斌， 曹雅忠， 等. 河南部分地区花生田地下害虫发生情况调查［J］. 植物保护， 2009， 35（2）： 104108.

［8］ 聂红民， 李国生. 花生田蛴螬发生原因及防治措施［J］. 农业科技通讯， 2005（6）： 18.

［9］ 王丙丽， 王洪亮. 花生田蛴螬的成灾原因及综合治理［J］. 河南农业科学， 2006（7）： 6668.

［10］刘爱芝， 李素娟， 武予清， 等. 河南省蛴螬爆发原因浅谈及防治对策［J］. 河南农业科学， 2001（4）： 1920.

［11］李耀发， 党志红， 安静杰， 等. 河北省主要作物田地下害虫种类及其分布［J］. 中国农学通报， 2018， 34（28）： 114119.

［12］雷雪萍. 我国地下害虫绿色防控技术研究进展［J］. 现代农业科技， 2022（24）： 9194.

［13］张美翠， 尹姣， 李克斌， 等. 地下害虫蛴螬的发生与防治研究进展［J］. 中国植保导刊， 2014， 34（10）： 2028.

［14］颜珣， 郭文秀， 赵国玉， 等. 昆虫病原线虫防治地下害虫的研究进展［J］. 环境昆虫学报， 2014， 36（6）： 10181024.

［15］李而涛， 李建一， 李晓峰， 等. 昆虫病原线虫防治蛴螬增效措施概述［C］∥陈万权. 绿色植保与乡村振兴. 北京：中国农业科学技术出版社， 2018： 199206.

［16］JAVED S， KHANUM T A， ALI A. Storage and efficacy of entomopathogenic nematode species as a biocontrol agent against the armyworm， Spodoptera litura （Fabricius） （Lepidoptera： Noctuidae） ［J］. Egyptian Journal of Biological Pest Control， 2022， 106（3）： 11121117.

［17］GUO Wenxiu， ZHAO Guoyu， WANG Congli， et al. Efficacy of entomopathogenic nematodes for the control of white grub， Anomala corpulenta Motschulsky， in laboratory and field ［J］. Nematology， 2020， 106（3）： 11121117.

［18］刘树森， 李克斌， 刘春琴， 等. 河北异小杆线虫一品系的分类鉴定及其对蛴螬致病力的测定［J］. 昆虫学报， 2009， 52（9）： 959966.

［19］武海斌， 刘海峰， 宫庆涛，等. 昆虫病原线虫防治地下害虫的应用及影响因子［J］. 落叶果树， 2015， 47（5）： 2427.

［20］李根， 许文君， 王新中， 等. 不同品系昆虫病原线虫对烟草小地老虎的致病力［J］. 环境昆虫学报， 2017， 39（5）： 10251031.

［21］梁铭荣， 李子园， 戴钎萱， 等. 4种昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的致死作用［J］. 生物安全学报， 2020， 29（2）： 8289.

［22］李而涛， 曹雅忠， 张帅， 等. 昆虫病原线虫Heterorhabditis beicherriana LF品系与Bt HBF18菌株混用对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果［J］. 昆虫学报， 2019， 62（5）： 602614.

［23］LI Ertao， ZHANG Shuai， LI Kebin， et al. Efficacy of entomopathogenic nematode and Bacillus thuringiensis combinations against Holotrichia parallela （Coleoptera： Scarabaeidae） larvae ［J/OL］. Biological Control， 2021， 152. DOI： 10.1016/j.biocontrol.2020.104469.

［24］张彩铃， 王志敏， 王思雨， 等. 昆虫病原线虫对暗黑鳃金龟的致病力［J/OL］. 中国生物防治学报： 110. ［20221221］. DOI： 10.16409/j.cnki.2095039x.2022.03.025.

［25］杨淋凯， 朱小芳， 钱秀娟， 等. 甘肃省5种昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的致病力测定［J］. 草业科学， 2021， 38（10）： 20692076.

［26］陈贤群， 刘奇志， 曹景富， 等. 两种昆虫病原线虫防治核桃云斑天牛田间效果评价［J］. 中国生物防治学报， 2016， 32（4）： 456461.

［27］刘树森. 昆虫病原线虫的筛选鉴定及其对蛴螬的致病性研究［D］. 北京： 中國农业科学院， 2009.

［28］武海斌， 范昆， 辛力， 等. 昆虫病原线虫对小地老虎的致病力测定及防治效果［J］. 植物保护学报， 2015， 42（2）： 244250.

［29］孙瑞红， 李爱华， 韩日畴， 等. 昆虫病原线虫Heterorhabditis indica LN2品系防治韭菜迟眼蕈蚊的影响因素研究［J］. 昆虫天敌， 2004， 26（4）： 150155.