楮实子含药血清对成骨细胞功能的影响

颜志鹏，杜小康，杨鸿遒，温志刚，余腾烨，刘云，陈珺，2

（1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006；2.广东药科大学生物资源与创新药物研究中心，广东 广州 510006）

成骨细胞是主导骨形成的功能细胞，在骨骼发育、重塑和再生过程中发挥着重要的作用[1]，其数量与功能的变化与代谢性骨病（如骨质疏松症）的发生、发展和预后密切相关，是进行药物筛选和研发的主要靶细胞之一。楮实子（Fructus Broussonetiae,FB）收载于《中国药典》（2020 年版）一部，为桑科植物构树的干燥成熟果实，具有补肾清肝、明目利尿等作用，常用于腰膝酸软、虚劳骨蒸等病症[2]。历代医家认为其“味甘，性寒，无毒”，《名医别录》载楮实功用大补益，《日华子本草》云楮实壮筋骨[3]。现代药理学研究表明其可抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]，具有治疗阿尔兹海默症、肝硬化、腹腔积液等的潜力[7−8]，但尚未见楮实子影响成骨细胞功能的文献报道。楮实子中含有楮实子油、氨基酸、黄酮类化合物、生物碱、皂苷类和多糖等成分[9]，其中黄酮类化合物包括红色素、芹菜素、槲皮素等[10]，研究表明黄酮类化合物多具有抗成骨细胞凋亡[11]和促进成骨细胞增殖、分化矿化[12−15]等生物活性，因此推测，楮实子提取物可能对成骨细胞功能产生积极影响。

本实验采用血清药理学方法，将楮实子水煎剂灌胃大鼠后分取血清，作用于原代培养的大鼠成骨细胞，观察含药血清对成骨细胞增殖、分化及其功能的影响，为楮实子在代谢性骨病防治中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器与实验动物

1.1.1 实验动物 3 月龄SPF 级雌性SD 大鼠16 只，体质量（300 ± 20）g，购自广东省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002；SD 大鼠乳鼠（＜24 h），购自珠海百事通生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2020-0051。实验经广东药科大学实验动物中心伦理审查，批准号gdpu‐lacspf2017477。

1.1.2 试剂 楮实子（康美药业股份有限公司，批号：200604531），由广东药科大学中药学院马鸿雁副教授鉴定为正品；DMEM 高糖培养基（Gibco 公司，批号：8122595）；胎牛血清（Gibco 公司，批号：42F1394K）；EDTA（Sigma 公司，批号：BCBV2141）；β-甘油磷酸钠（Sigma 公司，批号：BCCC6949）；地塞米松（Sigma公司，批号：D1756）；维生素C（Sigma公司，批号：SLBN3883V）；I 型胶原酶（Sigma 公司，批号：17100-017）；MTT（噻唑蓝，Amresco 公司，批号：475989）；碱性磷酸酶（AKP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A059-2-2）；水合氯醛（麦克林，批号：C12195151）；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：121820210409）；茜素红S（北京索莱宝公司，批号：20160127）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海贝博科技有限公司，批号：062122220804）；RIPA 裂解液（强）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：061721210930）；β-actin鼠单克隆抗体（Abcam公司，批号：ab8226）；OSX 兔单克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab209484）；Coll-I 鼠单克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab6308）；ALP 兔单克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab95462）；OPN 兔单克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab8448）；OPG 兔单克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab73400）；辣根过氧化氢酶标记二抗鼠抗（Abcam公司，批号：ab6789）；辣根过氧化氢酶标记二抗兔抗（Abcam公司，批号：ab6721）。

1.1.3 主要仪器 SW-CT 系列洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Galaxy S+系列二氧化碳培养箱（New Brunswick Scientific 公司）；TDZ5-WS 台式多管低速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；J-D200 倒置生物显微镜（深圳拓天仪器设备有限公司）；沃特浦wp-up-uv-20 型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理有限公司）；Sorvall ST 16R 型4 ℃高速离心机（Thermo fisher Scientific 公司）；PowerPac HC电泳仪（Bio-Rad公司）；Tanon 4100 凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；Microplate Reader 680 酶标仪（Bio-Rad公司）等。

1.2 含药血清制备与含药（空白）培养基配制

含药血清的制备：取10 g 楮实子与100 mL 蒸馏水混合，浸泡1 h 后煎煮1.5 h，滤出药液，过滤后的药渣再加100 mL 蒸馏水煎煮1.5 h，合并2 次滤液，浓缩制成终质量浓度为200 mg/mL 的楮实子水煎剂。SD 大鼠随机分为空白对照组（8 只）和药物组（8 只），分别灌胃生理盐水（5 mL/kg）和楮实子水煎剂（生药含量1 g/kg），连续灌胃10 d，剂量按临床用量换算；末次给药前大鼠禁食不禁水12 h，末次给药后1 h，5%（φ）水合氯醛麻醉大鼠后，进行心脏穿刺采血并分离血清，每组血清混匀、过滤除菌后分装，置于−80 ℃冰箱备用。实验时将空白血清及含药血清用无血清成骨诱导培养基（含终浓度为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10−8mol/L 地塞米松和50 mg/L 维生素C 的DMEM 高糖培养基）配成终浓度分别为5%、10%、20%的培养基。

1.3 成骨细胞分离培养

新生乳鼠处死后置于75%（φ）酒精中浸泡消毒10 min，无菌操作分取颅骨置于含磷酸缓冲溶液（PBS）的培养皿中，清除骨膜、血管和结缔组织后剪成1 mm3大小的骨片，加入胰酶-EDTA 溶液消化15 min（37 ℃），弃去消化液后加入I 型胶原酶消化1 h（37 ℃），3 000 r/min 离心5 min，弃上清，再次加入I 型胶原酶37 ℃消化1 h（37 ℃），离心并弃上清后加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基重悬细胞并转移至培养皿中，置于37 ℃、5%（φ）CO2培养箱中培养。待细胞长至80%～90%融合时以酶消化法传代培养，从P2代细胞开始使用成骨诱导培养基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中加入终浓度为10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10−8mol/L地塞米松和50 mg/L 维生素C）培养。取P3-P5 代成骨细胞进行后续实验。

1.4 成骨细胞鉴定

取P3 代成骨细胞接种于24 孔板，培养24 h 细胞贴壁后弃去培养基，95%乙醇固定细胞后根据AKP 染液试剂盒使用说明书进行染色并在倒置显微镜下观察、拍照。

1.5 成骨细胞增殖率检测

成骨细胞以1×104个/mL 的细胞密度接种于96孔板，设5%、10%、20%空白血清对照组，5%、10%、20%含药血清组，每组6复孔。培养48 h后，弃去培养基并加入MTT 试剂100 μL，37 ℃孵育4 h 后去除上清液，加入100 μL DMSO 溶液，在酶标仪570 nm波长处测定吸光度（A）值。分别以同浓度空白血清组为对照计算同浓度含药血清组成骨细胞的相对存活率；以5%空白血清组为对照组计算10%和20%空白血清组成骨细胞的相对存活率；以5%含药血清组为对照组计算10%和20%含药血清组成骨细胞的相对存活率。

1.6 成骨细胞AKP活性和矿化结节检测

成骨细胞以2×104个/mL 的细胞密度接种于24孔板，设10%空白血清对照组和10% 含药血清组，每组5复孔。培养72 h后，吸取适量上清液，按AKP试剂盒说明书操作，在酶标仪450 nm 波长处测定吸光度（A）值。连续培养21 d后，以茜素红染液染色，观察矿化结节的数量、体积与着色，并通过BIOQUANT OSTEO 自动图像分析软件计数各组细胞20倍镜下5个视野的矿化结节数量。

1.7 成骨细胞蛋白提取与成骨功能指标相关基因的蛋白表达测定

成骨细胞以5×108个/mL 的细胞密度接种于10 cm×10 cm 培养皿，分组处理同“1.6”。培养48 h后，加入RIPA 蛋白抽提试剂提取总蛋白，按BCA 蛋白质定量试剂盒说明书操作，在酶标仪562 nm 波长处测定吸光度（A）值，并根据标准曲线计算各组蛋白浓度。各组取等量蛋白经12% SDS-PAGE 电泳后转膜1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），再以含5%脱脂奶粉的TBST 溶液进行封闭处理，封闭完成的膜经TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入一抗（1∶3 000），置于4 ℃摇床轻摇过夜，第2 天室温孵育1 h并经TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入二抗（1∶5 000），4 ℃摇床轻摇1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），经曝光、显影、定影后，以Uvipro凝胶成像系统扫描并采用Image J 软件测量各蛋白条带吸光度值，以目的蛋白和内参蛋白的吸光度比值表示目的蛋白表达水平。

1.8 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 对实验结果进行统计分析，实验数据以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞的鉴定

原代成骨细胞培养12～24 h 后开始伸展贴壁，48～72 h 贴壁完全；经成骨诱导培养基培养后，细胞呈饱满的多角形或梭形，连续培养7 d 后，细胞大多呈多角立方形，细胞中央可见轮廓清晰的圆形或卵圆形细胞核，经AKP染色后细胞呈蓝紫色（如图1）。

图1 成骨细胞碱性磷酸酶染色鉴定Figure 1 Identification of osteoblasts by alkaline phosphatase staining（40×）

2.2 楮实子对成骨细胞增殖率的影响

成骨细胞增殖率测定结果如表1 所示，楮实子各浓度含药血清实验组所测得A 值均高于空白血清对照组，说明楮实子含药血清可显著促进成骨细胞增殖（P＜0.01）；不同浓度空白血清组组间差异无统计学意义；与5%含药血清组相比，10%和20%含药血清组成骨细胞增殖率明显提高（P＜0.05），但10%和20%含药血清组组间差异无统计学意义，结合文献[16]，选择10%含药血清浓度进行后续实验。

表1 成骨细胞增殖率测定结果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

表1 成骨细胞增殖率测定结果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

注：1.与同浓度空白血清组比较计算相对增殖率，与同浓度空白血清组比较：**P＜0.01；2.与5%空白血清组比较计算相对增殖率；3.与5%含药血清组比较计算相对增殖率，与5%含药血清组比较：#P＜0.05。

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2.3 楮实子对成骨细胞AKP 活性和矿化结节形成的影响

成骨细胞AKP 活性检测结果如表2 所示，10%含药血清组成骨细胞的AKP 活力明显高于10%空白血清组（P＜0.01），说明楮实子含药血清能显著促进成骨细胞分化。成骨细胞矿化结节茜素红染色结果如图2 所示，计数结果如表2 所示。与10%空白血清组相比，10%含药血清组成骨细胞矿化结节体积明显增大，数量明显增加（P＜0.01），说明楮实子含药血清可以促进成骨细胞矿化结节的形成。

表2 成骨细胞AKP活力测定结果与矿化结节计数结果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

表2 成骨细胞AKP活力测定结果与矿化结节计数结果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

与同浓度10%空白血清组比较：**P＜0.01。

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图2 成骨细胞矿化结节染色结果（A图：1×，B图：20×）Figure 2 Staining results of mineralized nodules in osteoblasts

2.4 成骨细胞功能指标基因表达检测结果

Western blot 结果如图3 所示，10%含药血清组成骨细胞上OSX、Coll-I、ALP、OPN 和OPG 的蛋白表达均明显升高（P＜0.05），说明楮实子对成骨细胞的骨形成有积极作用。

图3 成骨功能指标基因的蛋白表达Figure 3 Expression of osteogenic function indicator proteins(,n=3)

3 讨论

楮实子是桑科植物构树的干燥成熟果实，收载于《中国药典》（2020 年版）一部，常用于肝肾不足、腰膝酸软、虚劳骨蒸等病症[2]，古籍载其功用大补益、能壮筋骨等[3]。现代药理学研究发现楮实子对小鼠多种实体瘤均有抑制作用，并能显著清除羟基自由基，具有较强的体外抗氧化作用[4−5]；楮实子也具有抗皮肤光老化的能力[6]，并能抑制Aβ沉积、改善学习记忆能力[8]，但目前尚未见楮实子调节骨代谢、影响成骨细胞功能的文献报道。

刘宏伟等[9−10]对楮实子的化学成分进行提取并分析，发现楮实子中含有多种黄酮类化合物，如红色素、芹菜素、槲皮素及淫羊藿等。另有研究认为黄酮类化合物多具有促进成骨细胞增殖、分化矿化的能力[17]，如槲皮素能恢复经甲基乙二醛处理后的成骨细胞的GSK-3β磷酸化以及Nrf2 蛋白表达水平并能抑制该成骨细胞凋亡[11]；淫羊藿苷则能促进前成骨细胞增殖，并通过激活BMP 等信号通路来促进成骨细胞增殖、分化和基质钙化[12−15]。因此推测，楮实子提取物可能对成骨细胞功能产生积极影响。

血清药理学是指中药或中药复方按一定剂量给动物灌胃一定时间后，采集动物的血液并分离血清，以含药血清作为药物直接加入离体反应系统中来研究药理机制的一种半体内实验方法[18]。中药所含化学成分在生物体内环境下会发生复杂的代谢或生物转化，即中药煎煮后得到的化合物可能只是活性成分的前体，且将中药直接作用于细胞可能会出现较大的毒性反应[19]，采用血清药理学方法进行研究则能通过体外实验观察中药的药理效应[20]。在血清药理学研究中，含药血清的制备需要考虑供体动物种属的选择，供体动物是否需要造模，以及药物的给药方式、时间及采血时间等问题[21]。本实验中，制备含药血清的动物与提取原代成骨细胞的动物种属一致，可以有效避免实验受到因种属差异带来的免疫源性等不利影响[22]；参照楮实子的临床给药剂量（6～12 g/d）[2]，按《中药药理研究方法学》中人与大鼠体表面积系数法计算大鼠实验剂量为0.9 ～1.8 g/kg[23]，本实验中以1 g/kg 剂量连续灌胃给药10 d，以确保含药血清浓度达到稳定[24]。

MTT 实验结果表明，与同浓度空白血清组相比，楮实子含药血清在5%、10%和20%浓度时均可显著促进成骨细胞增殖，但各浓度空白血清组组间无显著性差异；扣除空白血清的影响后，10%和20%楮实子含药血清组成骨细胞的增殖率明显高于5%含药血清组，但10%和20%楮实子含药血清组组间无明显差异，因此，选择10%浓度的含药血清进行后续实验，这也与血清药理学研究中公认的血清添加浓度一致[16]。

骨形成过程中成骨细胞会经历细胞增殖、细胞外基质形成与成熟和基质矿化3 个时期，期间将产生细胞外基质蛋白和基质矿化调节因子等多种生物活性物质，并最终分化为成熟的骨细胞[25]。成骨细胞AKP活性能反映其分化能力，矿化结节数量则能反映其矿化功能，本研究结果表明楮实子含药血清能显著提高成骨细胞的AKP 活性和矿化结节数量，说明楮实子能促进成骨细胞的分化和矿化。OSX、ALP、OPN 等蛋白是成骨细胞分化、矿化进程中的标志性蛋白，检测其变化能反映成骨细胞的分化、矿化进程和成骨功能[26−27]。本研究结果表明楮实子含药血清能显著上调OSX、Coll-I、ALP、OPN和OPG 等成骨功能标志蛋白的表达水平，说明楮实子对成骨细胞的骨形成有积极作用。

综上所述，楮实子能促进成骨细胞增殖、分化和矿化，并通过上调成骨调节因子促进成骨细胞及细胞基质的成熟，进而增强成骨功能，但具体分子机制还有待后续研究深入探讨。本研究结果表明楮实子具有防治代谢性骨病的潜力，为后续进一步明确楮实子的骨保护作用提供了实验依据。