基于HS-GC-IMS 技术分析桑叶发酵过程中挥发性物质的差异

2024-02-21 02:35李学震孙庆泽刘光鹏马艳蕊吕绪强崔艳平和法涛
中国果菜 2024年1期
关键词:金花桑叶挥发性

李学震,孙庆泽,刘光鹏,马艳蕊,吕绪强,崔艳平,和法涛*

(1.中华全国供销合作总社济南果品研究所,山东 济南 250220;2.山东省果蔬贮藏加工技术创新中心,山东 济南 250220;3.山东农业工程学院食品科学与工程学院,山东 淄博 250100)

桑叶(Folium Mori)是桑科(Moraceae)桑属(Morus L.)植物的叶片,富含生物碱、必需氨基酸、酚类化合物和多糖等生物活性成分[1]。其中,1-脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin)作为一种生物碱,在桑叶中含量为1‰左右,能有效抑制血糖生成,起到降血糖的作用[2-3]。但桑叶具有生青味与豆腥味,在饮料、茶等产品的应用过程中会产生不良风味,影响消费者感官体验。

金花菌(Aspergillus chevalieri)是茯砖茶中的一类真菌,分为有性型(Eurotium)和无性型(Aspergillus)两类,目前多数学者认为金花菌是冠突散囊菌(Eurotium cristatum)[4]。Rui 等[5]将茯砖茶中金花菌分离纯化后得到A.chevalieri、A.cristatus、E.cristatum 等多种菌株,因此有学者有认为金花菌是一类菌群。研究表明,经过金花菌发酵后能增加黑毛茶的陈香和花香,并增加黄酮类、醇类、酯类和醛类等化合物含量,减少以生青气味为特征的萜烯类物质含量和种类[6-7]。目前,关于桑叶发酵方面的研究主要集中在桑叶茶和动物饲料的加工中,直接利用金花菌发酵桑叶的研究较少,并且发酵过程中挥发性物质变化规律不明确。顶空气象离子迁移谱(HS-GC-IMS)技术是一种快速鉴别样品中挥发性物质差异性的可视化技术,常用于农产品、中药材、食品、发酵产品等的挥发性物质鉴定,具有灵敏度高、检测方便快捷、可视化程度高等优点[8]。鉴于此,本研究利用HS-GC-IMS 技术明确桑叶发酵过程中的挥发性物质差异,为桑叶提取物、果蔬发酵和动物饲料等方面的加工与应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

金花菌(A.chevalieri)分离自茯砖茶,保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏号:CGMCC No.23051;桑叶(干燥),山东省临清清源正本生物医药科技有限公司;PDB(马铃薯葡萄糖培养基),北京索莱宝生物科技有限公司;C4~C9混合正构酮标准品,色谱纯,济南海能仪器有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱离子迁移谱仪,SPL-250,德国G.A.S 公司;分析天平,ME-104,梅特勒托仪器有限公司;BSC-150 恒温培养箱、YXQ-LS-100A 立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂; 恒温调速摇床柜,ZWYR-2112B,上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液制备

取保藏于-80 ℃冰箱的金花菌种子液,接入PDB 培养基中活化5~7 d,培养温度30 ℃,摇床转速150 r/min,待菌丝布满摇瓶中,根据GB 4789.2—2022 测菌落总数,制备菌落数约为1.16×108CFU/mL 的种子液。

1.3.2 桑叶发酵

取15 g 桑叶于三角瓶中,115 ℃灭菌15 min,加入12 mL 种子液,发酵温度30 ℃,分别发酵3、5、7、9、11 d,同时设置空白对照组[9](每组设置3 个平行)。发酵好的桑叶放入60 ℃干燥箱内烘干,研磨后置于干燥器内保存备用,并分别标注A 组(未发酵)、B 组(发酵3 d)、C 组(发酵5 d)、D 组(发酵7 d)、E 组(发酵9 d)、F 组(发酵11 d)。

1.3.3 GC-IMS 检测挥发性成分

根据Wang 等[10]的方法进行检测并稍作修改。分别称取1 g 桑叶粉末于20 mL 顶空进样瓶中,每组设置3个平行,以500 r/min 的转速,40 ℃孵育15 min 后开始进样。

GC-IMS 条件:MXT-5 气相色谱柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),IMS 温度45 ℃,色谱柱温度60 ℃,进样针温度85℃,载气/ 漂移气N2(纯度99.999%),分析时间20min,进样体积500 μL。

气相色谱条件:0~2 min,漂移气150 mL/min,载气2mL/min;2~10min,漂移气150mL/min,载气2~10mL/min;10~20 min,漂移气150 mL/min,载气10~100 mL/min。

1.4 数据处理

GC-IMS 仪器中配备的Vocal 软件进行数据查看、定性和谱图分析,使用软件内置的IMS 数据库和Hanon 数据库进行物质定性分析;Gallery 插件、Reporter 插件和Dynamic PCA 插件分别用于指纹图谱的绘制、图谱差异对比和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 发酵桑叶挥发性物质定性分析

气相离子迁移色谱(GC-IMS)是一种快速、无损和高通量的检测技术,在食品、中草药和天然产物等挥发性物质的检测中起到重要作用[11]。通过HS-GC-IMS 分析,揭示了桑叶发酵过程中挥发性物质的差异,在测试的6个样品中(A~F 组)共检出68 种挥发性物质,与数据库匹配定性出45 种,如表1 所示,主要有醇类10 种、醛类10 种、酯类9 种、酮类8 种、醚、烯和酸类各2 种、烷烃和噻唑各1 种。其中,1-辛烯-3-醇、庚醛、戊醛、异戊醛等物质在桑叶发酵茶的研究中有所报道[12]。

表1 桑叶发酵过程中主要挥发性物质Table 1 The main volatile substances in the fermentation of mulberry leaves

2.2 桑叶发酵过程中挥发性物质差异对比

图1 是桑叶发酵过程中HC-GC-IMS 二维差异图。以未发酵的桑叶为参比,对其他发酵时间的谱图进行了扣减参比。深色表示挥发性物质高于参比,浅色表示挥发性物质低于参比,点的面积大小和颜色深浅表示该物质的相对含量多少[13]。图1 中多数信号峰的保留时间为100~400 s(400~500 s 数据不是发酵桑叶中的主要物质,因此不做分析),迁移时间为1.0~2.0 ms 区域,桑叶经过发酵后挥发性物质种类丰富,部分物质减少甚至消失。

图1 桑叶发酵过程中HS-GC-IMS 二维差异谱图Fig.1 HS-GC-IMS two-dimensional difference spectrum during mulberry leaf fermentation

结合指纹图谱(图2)分析,发酵前后共有的挥发性物质有乙二醇二甲醚、乙二醇一丁醚、甲基庚稀酮、(E,E)-2,4-庚二烯醛、乙酸甲酯、反式-2-戊稀醛、丁酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、2-庚酮和甲基异丁基酮,这些挥发性物质都具有水果香气或花草香气(图2c);通过‘金花菌’发酵能使苯甲醛甘油缩醛(具有苦味)、硫丙醇(具有臭味)[14]、1-辛烯-3-醇(具有土腥味)[15]、1-戊稀-3-酮(具有辛辣刺激性气味)和己醇(具有青草、嫩枝叶气味)等具有不良气味的物质消失(图2b);增加了异丙基乙酸酯、3-羟基丁酸乙酯[16]、甲酸丁酯和2-庚酮等具有水果香气的物质,还有γ-丁内酯[17]、3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)[18]和4-甲基噻唑等物质赋予了桑叶奶油和脂肪类香气(图2a)。

图2 不同发酵时间桑叶挥发性物质指纹图谱Fig.2 Fingerprint of volatile substances in mulberry leaves at different fermentation times

2.3 发酵桑叶过程中挥发性物质聚类分析

PCA 被广泛应用于鉴别植物样本的特征成分、挥发性物质和生物活性,其有效性也被广泛证明,它能针对多个指标进行降维,转换成几个具有代表性的综合指标[19]。如图3 所示,两个主成分累计贡献率为85%,能较好地表示原始变量的特征差异,并能将未发酵、发酵3 d和发酵5~11 d 的桑叶进行区分,表明‘金花菌’发酵能明显改变桑叶中的挥发性物质。

图3 发酵桑叶过程中主成分分析Fig.3 Principal component analysis in fermentation of mulberry leaves

3 结论

将HS-GC-IMS 技术与PCA 结合,对‘金花菌’发酵桑叶过程中挥发性物质进行检测和分析。结果共检出挥发性物质45 种,主要有醇类10 种、醛类10 种、酯类9种、酮类8 种、醚、烯和酸类各2 种、烷烃和噻唑各1 种。‘金花菌’发酵能使桑叶中苯甲醛甘油缩醛、硫丙醇、1-辛烯-3-醇、1-戊稀-3-酮和己醇等具有不良气味的物质消失;增加异丙基乙酸酯、3-羟基丁酸乙酯、甲酸丁酯、2-庚酮、γ-丁内酯、3-羟基-2-丁酮和4-甲基噻唑等具有水果和奶油气味的物质。PCA 能较好地区分未发酵、发酵3 d 和发酵5~11 d 的桑叶,该研究为桑叶风味改良和桑叶茶发酵提供参考。

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