HPLC法测定头孢噻肟钠的有关物质

张建廷，张巍

（东北制药集团股份有限公司，辽宁 沈阳 110027）

头孢噻肟钠属于β-内酰胺类抗生素，名称为(6R,7R)-3-[(乙酰氧基)甲基]-7-[2-氨基-4-噻唑基-(甲氧亚氨基)乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸钠盐，20世纪70年代由Hoechst（德国）公司和Russel（法国）公司联合研制，作为第3代头孢菌素类抗生素，其临床应用十分广泛[1-3]。

头孢噻肟钠在《中国药典》2020年版、《日本药典》18版、《美国药典》43版及《欧洲药典》10.0版中均有收载[4-7]，且有文献报道注射用头孢噻肟钠有关物质的测定方法及杂质谱研究[8-10]，根据本品的合成工艺路线、参考文献及各国药典，建立了头孢噻肟钠原料药有关物质的测定方法，为质量标准的制定提供指导依据。

1 实验部分

1.1 仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪；安捷伦C18色谱柱；AL204型和XPE26型天平（梅特勒 托利多）；FE20型酸度计（梅特勒 托利多）。

1.2 试剂

头孢噻肟钠原料药（批号：S442001、S442002、S442003，华北制药华民药业）；头孢噻肟对照品（中国食品药品检定研究院）；杂质对照品（中国食品药品检定研究院、山东致纯医药科技有限公司、广州牌牌生物科技有限公司和石家庄合佳保健品有限公司）；磷酸二氢钾、磷酸和无水磷酸氢二钠（AR，国药集团）；乙腈（HPLC，Fisher）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用安捷伦 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速为每分钟1.0 mL；30 ℃柱温；235 nm波长；4 ℃进样室温度；进样10 μL；以pH6.2的磷酸氢二钠缓冲溶液（称取3.6 g无水磷酸氢二钠，加水1 000 mL溶解，用磷酸调pH值至6.2）∶乙腈=98∶2为流动相A，以pH6.2的磷酸氢二钠缓冲溶液∶乙腈= 40∶60为流动相B，梯度洗脱，见表1。

表1 线性梯度洗脱程序

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液的配制

稀释剂（取4.6 g无水磷酸氢二钠，3.5 g磷酸氢二钾，加水1 000 mL溶解）。

2.2.2 供试品溶液的配制

精密称取原料药适量，加稀释剂溶解，配制成质量浓度约为1 mg·mL-1的溶液。

2.2.3 对照溶液的配制

精密量取供试品溶液适量，加稀释剂稀释，配制成质量浓度约为0.01 mg·mL-1的溶液。

2.2.4 杂质对照贮备溶液的配制

精密称取杂质7-ACA、杂质J、杂质A～H共10个对照品各2 mg，配制成质量浓度约为0.2 mg·mL-1的溶液，作为各杂质对照贮备溶液。

2.2.5 杂质定位溶液的配制

精密量取各杂质对照贮备溶液适量，配制成质量浓度约为0.01 mg·mL-1的溶液。

2.2.6 杂质混合对照溶液配制

杂质贮备液1：精密称取5 mg杂质A、杂质C和2.5 mg的杂质B、杂质D、杂质E和杂质F，置100 mL量瓶中，加稀释剂超声溶解后定容，摇匀。

杂质贮备液2：精密称取5 mg杂质G，2.5 mg头孢噻肟对照品，杂质H、7-ACA和杂质J各3.75 mg，置500 mL量瓶中，加稀释剂超声溶解后，定容，摇匀。

精密量取杂质贮备液1和2各5 mL，置25 mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，作为杂质混合对照溶液。

2.2.7 系统适用性溶液配制

精密称取头孢噻肟对照品适量，加入杂质对照贮备溶液，配制成头孢噻肟质量浓度为1 mg·mL-1及各杂质质量浓度为0.01 mg·mL-1的混合溶液。

2.3 专属性

取稀释剂、系统适用性溶液、各杂质定位溶液、对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪10 μL，记录色谱图。结果空白溶剂不干扰主成分和各杂质检测，各色谱峰间分离度满足要求。

2.4 精密度

2.4.1 仪器精密度

连进5针杂质混合对照溶液，计算杂质峰面积RSD均小于2%，说明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性

取供试品溶液和对照溶液，按“2.1”色谱条件采样分析，有关物质含量按自身对照法计算，RSD均小于30%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.3 中间精密度

为考察随机变动因素对测定结果的影响，由另一分析人员在另一日期，使用不同仪器对样品进行检测，按“2.1”色谱条件采样分析，取平行配制的供试品溶液和对照溶液，各6份，按外标法计算，12份中杂质H、7-ACA、杂质B、杂质J、杂质A、杂质E、杂质C、杂质F、杂质D、杂质G含量的RSD分别为1.6%、4.5%、8.9%、22.1%、8.0%、9.6%、3.1%、2.1%、2.0%、14.2%，表明方法精密度良好。

2.5 定量限与检测限

采用逐步稀释法测定检测限（S/N≈3）和定量限（S/N≈10），结果表明均能满足各杂质的检测要求，结果见表2。

表2 检测限和定量限结果

2.6 线性和范围

分别精密量取按“2.2.5”方法配制的杂质贮备液1和2各 2.5 mL，4 mL，5 mL和 7.5 mL，置25 mL量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，即得系列标准线性溶液。按“2.1”项下色谱条件采样分析，以浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，作有关物质线性回归方程。结果见表3。

表3 有关物质线性回归方程

2.7 加样回收率

称取本品约25 mg，精密称定，共10份，分别置25 mL容量瓶中，加入“2.2.5”项下杂质贮备液1和杂质贮备液2各4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，各3份，分别加入稀释剂稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，按“2.1”项下色谱条件分别采样分析，取“2.2.5”项下杂质混合对照溶液同法测定，用外标法计算，结果见表4。

表4 有关物质回收率试验结果

2.8 耐用性

供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法制备，分别调整柱温、流速、pH值及不同品牌色谱柱采样分析，考察系统的耐用性。经测定，理论板数、分离度、杂质个数、杂质含量及总杂在室温30±2 ℃、流速1.0±0.2 mL·min-1、pH 6.2±0.1及使用不同品牌色谱柱时均符合规定，表明该方法耐用性良好。

2.9 溶液稳定性

供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法制备，分别置4 ℃条件下放置，按“2.1”色谱条件分别于 0 h、2 h和4 h采样分析，试验表明供试品溶液和对照溶液在4 ℃条件下均不稳定，故需临用新制。

2.10 样品测定

取头孢噻肟钠原料药（批号：S442001、S442002、S442003），供试品溶液和对照溶液分别按“2.2.2” 和“2.2.3”方法配制，按“2.1”色谱条件采样分析，结果3批样品杂质含量均符合要求。

3 结论

目前，头孢噻肟钠在《中国药典》2020年版、《日本药典》18版、《美国药典》43版及《欧洲药典》10.0版中均有收载，结合头孢噻肟钠原料药的合成工艺及降解试验分析其中的潜在杂质[11]，其中杂质B、D、E和F为降解杂质，其余为原料药工艺杂质。

经验证[12-14]，该方法适用于头孢噻肟钠原料药有关物质的检测，能够有效地控制产品质量。