益气养阴方对动脉粥样硬化大鼠免疫炎症因子和胸主动脉内、中膜厚度的影响*

谢 心，徐浣白，樊月月，罗 浩，吴 坚△

1 上海市中西医结合医院，上海 200082； 2 上海市第一人民医院，上海 200080

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是多种因素相互作用下发生的一种慢性炎症性血管病变［1］，是一种以脂质蓄积和炎性细胞浸润为主要特征的动脉血管壁慢性炎性反应［2］，通常伴有大量免疫细胞参与，为众多心脑血管疾病的共同病理基础［3］。超敏C 反应蛋白（hypersensitive Creactive protein，hs-CRP）、转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、白细胞介素8（Interleukin-8，IL-8）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是反映动脉粥样硬化炎症反应的免疫炎症因子。颈动脉内中膜厚度是反映动脉粥样硬化的窗口，有利于在早期发现病变［4］。益气养阴方是在经典名方生脉散基础上结合上海市名中医林钟香教授的临证经验加减化裁而来的方剂，由黄芪、党参、麦冬、五味子、枸杞子、桑寄生6 味中药组成，可益气养阴、调养心肾。既往的研究也发现益气养阴方治疗动脉粥样硬化大鼠，治疗前后白细胞介素6（interleukin-8，IL-6）、人可溶性血管细胞黏附分子1（human soluble vascular cell adhesion molecule 1，sVCAM-1）、人可溶性细胞间黏附分子1（human soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）及核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表达水平明显改善，较模型组差异有统计学意义（P＜0.05），能明显改善糖尿病动脉粥样硬化患者的血脂代谢、降低血尿酸水平，改善患者的临床症状［5-7］。为进一步探讨益气养阴方对动脉粥样硬化大鼠的作用机制，本研究观察治疗前后hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9的表达水平变化及胸主动脉内中膜厚度的改变，从炎症因子及内膜变化方面来揭示益气养阴方防治动脉粥样硬化的作用机制，以减少急性心脑血管事件的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级Wistar 雄性大鼠46 只，由上海中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2016-0003，饲养条件：室温22～24 ℃，相对湿度40%～60%。每5 只装1 个鼠笼，自由饮水，进食普通标准饲料，每天7∶00 至19∶00予以光照，适应性饲养1周后进行试验。动物实验严格遵守《实验动物福利伦理审查指南》。

1.2 实验药物益气养阴方（四川新绿色药业有限公司，中药颗粒剂，批号：20181202，规格：20 g/包，由黄芪、党参、麦冬、五味子、枸杞子、桑寄生6味中药组成）。瑞舒伐他汀钙片（浙江京新药业股份有限公司，批号：B2014381，规格：10 mg/片）。

1.3 试剂及仪器

1.3.1 实验仪器 普通高速离心机（Eppendorf公司，德国）；SM600 型酶标仪（上海永创医疗器械有限公司）；AU2700 型全自动生化分析仪（贝克曼公司，美国）；HistoCore ArcadiaH 包埋机、RM2235 型石蜡切片机、ASP300s 型组织病理脱水机（徕卡公司，德国）；BX51 型荧光生物显微镜（Olympus 公司，日本）；XW-80A 型旋涡振荡混合器（上海青浦泸西仪器厂，中国）；GL-1800 型干式恒温器（江苏海门其林贝尔仪器有限公司）。

1.3.2 实验试剂 大鼠TGF-β1ELISA 试剂盒，大鼠MMP-9ELISA 试剂盒，大鼠IL-8 ELISA 试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0181R1，MM-20918R1，MM-037351）；hs-CRP（乳胶增强免疫散射比浊法）试剂盒（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号：M100）；Masson 染液套装，苏木素-伊红染液（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：G1006，G1005）。

1.4 分组与造模46 只4 周龄SPF 级Wistar 雄性大鼠，随机选出10 只为空白组，只给予基础饲料，其余36 只为造模组。造模方法：主动脉内膜球囊拉伤术结合高脂饲料喂养法：大鼠仰卧固定，局部剃毛消毒，应用0.5%戊巴比妥钠30 mg/kg经腹腔静脉注射麻醉后，沿颈部前正中线，切开皮肤，游离出左颈外动脉3～4 cm，将颈外动脉先结扎其远端，近端应用线挑起以阻断血流，在两线之间血管段的血管上壁剪一小切口，逆行插入2.5～3.0 F 标准球囊导管至胸主动脉，深度约5 cm，向球囊内注入生理盐水0.1 mL，应用手推式压力注射器维持压力为4 个大气压，然后回拉导管至主动脉弓处，再回抽至囊内压为零，反复抽拉导管3次，以拉伤胸主动脉内皮，最后退出导管，结扎颈外动脉，逐层缝合。术前静脉注射肝素0.1 μg/kg予以抗凝，术后每只予青霉素80 万IU 肌肉注射3天，预防感染。术后造模组予高脂饲料喂养，高脂饲料配方：4%胆固醇+10%蛋黄粉+4%白糖+5%猪油+87%基础饲料，加工成颗粒状。高脂喂养8 周后各组随机取出2 只杀死，解剖颈动脉、胸主动脉以确定造模是否成功。造模成功后，各组在原有饲料喂养下，将实验动物30 只按随机数字表分为模型组、益气养阴方及瑞舒伐他汀钙组，每组10只。

1.5 药物干预空白组、模型组予等剂量的生理盐水灌胃。益气养阴方正常人剂量每日20 g，瑞舒伐他汀钙剂量每日10 mg，参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》大鼠的等效剂量=正常人每日剂量/60 kg×6.3；瑞舒伐他汀钙组予瑞舒伐他汀钙1.05 mg/（kg·d），每日1 次；益气养阴方组给予2.1 g/（kg·d），每日1 次。各组均干预6 周，所有动物自由饮水。

1.6 标本采集6 周后，腹主动脉取血后，应用过量的戊巴比妥钠处死所有实验大鼠，开胸截取胸主动脉至腹主动脉全长，生理盐水冲洗干净后，观察斑块形成情况，然后剪取斑块形成处组织分别作病理学HE及Masson染色及分子生物学检查。

1.7 观察指标

1.7.1 动物一般情况 观察所有大鼠，精神状态、毛色、日常活动能力，反应灵敏度、进食等情况。1.7.2 TGF-β1、IL-8、MMP-9 及hs-CRP 水平 严格按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤测定大鼠血清中TGF-β1、IL-8、MMP-9 的水平。采用乳胶增强免疫散射比浊法测定hs-CRP的浓度变化。

1.7.3 大鼠胸主动脉内、中膜厚度及病理学表现 采用OLYMPUS BX51 显微镜观察，软件分析：ImageView。染色方法：HE 染色及Masson 染色，放大比例为200。

1.8 统计学方法数据录入采用Excel 2019 完成，统计分析采用SPSS 24.0 软件进行，图片制作采用GraphPad Prism 8.0 软件实现。计量资料以描述，多组间比较采用完全随机设计资料的方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 动物一般情况适应性饲养期间，大鼠精神状态佳，毛色平顺有光泽，日常活动正常，反应灵敏，在进食量、饮水量、大小便方面都没有问题出现。造模后所有造模成功大鼠的精神状态变得萎靡不振，毛色变得枯槁、没有造模前的光泽感，活动量相对减少，反应相对迟钝，进食量、饮水量、小便相较于造模前均有明显的增加。经灌胃给药干预后，各给药组大鼠的精神状态、毛色、日常活动等一般情况均有不同程度的转好，各组均无大鼠死亡，体质量增长良好。

2.2 大鼠hs-CRP、TGF-β1表达水平与空白组比较，其余各组hs-CRP、TGF-β1表达水平增高（P＜0.05）；与模型组比较，益气养阴方组、瑞舒伐他汀组hs-CRP、TGF-β1表达水平均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀组低于益气养阴方组（P＜0.05））。见表1。

表1 各组大鼠炎症细胞因子水平、IT及MT比较（）

表1 各组大鼠炎症细胞因子水平、IT及MT比较（）

注：*表示与空白组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与益气养阴方组比较，P＜0.05

?

2.3 大鼠IL-8、MMP-9表达水平与空白组比较，其余各组IL-8、MMP-9 表达水平增高（P＜0.05）；与模型组比较，益气养阴方组、瑞舒伐他汀组hs-CRP、TGF-β1表达水平均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀组低于益气养阴方组（P＜0.05））。见表1。

2.4 大鼠胸主动脉内膜、中膜厚度与空白组比较，其余各组大鼠胸主动脉内膜（thoracic aortic intima，IT）、胸主动脉中膜（thoracic aortic media，MT）厚度均增加（P＜0.05）；与模型组比较，益气养阴方组、瑞舒伐他汀组IT 及MT 厚度均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀组低于益气养阴方组（P＜0.05））。见表1。

2.5 大鼠主动脉内膜病理学表现

2.5.1 胸主动脉各层细胞结构病理学表现 模型组胸主动脉壁黏膜层动脉粥样硬化斑块形成，内见大量泡沫细胞、胆固醇结晶和少量淋巴细胞，其余各组相比病变明显减轻，可见腹主动脉壁黏膜层局部薄层粥样斑块形成，斑块内见胆固醇结晶，少量增生的纤维组织、泡沫细胞和淋巴细胞。见图1。

图1 各组大鼠胸主动脉各层细胞结构病理学表现（HE，×200）

2.5.2 腹主动脉各层细胞结构病理学表现 模型组腹主动脉脂质沉积和炎性细胞浸润，纤维组织增生明显，内见大量泡沫细胞、胆固醇结晶，其余各组病变炎性细胞浸润、纤维组织增生明显减轻，可以看出益气养阴方组大鼠胸主动脉各层细胞结构的组织修复方面与模型组有显著差异。见图2。

图2 各组大鼠腹主动脉各层细胞结构病理学表现（Masson，×200）

3 讨论

动脉粥样硬化在中医学中没有专有病名，但与其相关的临床表现及发病特点的论述散见于历代文献，如“消渴”“胸痹”“中风”“瘀证”“痰证”“脉痹”等。究其基本病机多为本虚标实，其发病多见于中老年人，脏器虚损，机能紊乱，脏腑阴阳气血亏虚，而诸虚中又以气阴两虚为主，治疗方法以益气养阴为主。益气养阴方是在经典名方生脉散基础上结合上海市名中医林钟香教授的临证经验加减化裁而来，由黄芪、党参、麦冬、五味子、枸杞子、桑寄生6 味中药组合而成。方中黄芪味甘、性微温，可健脾益气，补益后天，充养先天；党参味甘、性平，健脾补气，补肺益气；麦冬、五味子入肺、胃、心经，养阴清热，养心除烦；桑寄生、枸杞子补肝血，滋肾阴，使水火相济，心肾相交，培阴精之本。诸药合用，共奏益气养阴、补益肝肾之功。

hs-CRP 直接影响动脉粥样硬化斑块与血栓形成，且已被证实是慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素［8］。TGF-β1是一种含有两个肽链的蛋白质，在体内经蛋白水解酶（如纤溶酶和组织蛋白酶D）激活与靶细胞膜上特异性受体结合介导跨膜信号转导［9］。IL-8在炎症反应中起核心调节作用，是炎症免疫反应的重要介质［10-11］，而且与疾病的活动性相关，是动脉粥样硬化的一个重要的危险因子［12-14］。MMP-9通过降解基底膜胶原，减少纤维帽内胶原纤维及结缔组织，使纤维帽变薄，在斑块纤维帽的崩解和随后的斑块破裂中起重要作用，促进中膜内平滑肌细胞向内膜迁移，因此在动脉粥样硬化斑块中，斑块表面纤维帽的厚度、强度及其胶原组织含量的多少对于防止粥样斑块破裂至关重要，因此hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9 影响着动脉粥样硬化的发生和进展［15-18］。

本研究结果表明，益气养阴方对动脉粥样硬化大鼠治疗前后hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9的表达水平有明显的下降，对胸主动脉内膜及中膜的厚度有明显改善作用，说明益气养阴方能明显降低动脉粥样硬化大鼠炎症因子的表达，改善胸主动脉内中膜厚度，有助于动脉粥样硬化大鼠主动脉各层细胞结构的组织修复，减轻斑块组织中炎症细胞浸润及纤维组织增生，为我们进一步挖掘干预糖尿病动脉粥样硬化患者免疫炎症损伤进展的有效中药复方提供了一个研究思路，有助于减少急性心脑血管事件的发生及发展。