壳聚糖及季铵化壳聚糖作为疫苗佐剂的研究进展

马淑敏，项婷婷 综述，沃恩康 审校

杭州医学院检验医学院生物工程学院，浙江杭州 310013

近年来，预防性疫苗接种对于应对各种流行性传染病发挥了巨大作用。疫苗已从减毒活疫苗或灭活疫苗发展到亚单位疫苗。传统疫苗的抗原物质被抗原提呈细胞处理后可引起免疫应答，但会出现一些副反应。亚单位疫苗通常只含有1 种或多种抗原成分，安全性大幅提高，但免疫原性较弱，因此需添加高效的佐剂［1］。目前最常用的疫苗佐剂为铝盐佐剂，研究显示，铝盐佐剂能促进机体的Th2型反应［2］，不能诱导Th1 型免疫应答［3］，而Th1 型免疫应答对细菌和病毒等微生物感染的保护作用至关重要。其他佐剂如细胞因子佐剂，具有生产成本较高，注射部位易产生较严重毒副作用［4］，不能诱导黏膜免疫［5］等缺点。因此，研发新型疫苗佐剂十分必要。

壳聚糖是一种天然阳离子碱性多糖，是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的高分子化合物。其为甲壳类动物壳、真菌细胞壁和昆虫的甲壳素在碱性条件下的脱乙酰化产物［6］。壳聚糖生物降解性高、生物相容性好、黏附性强、无毒性，具有抑菌、抗癌等多种生理功能，但其溶解度受pH 条件的影响，只能在酸性条件下溶解，限制了其在生物医学领域的应用［7］。通过对壳聚糖进行化学修饰，可不同程度地提高其溶解性，其中季铵化壳聚糖具有广阔的应用前景。依据季铵盐基团是否直接引入壳聚糖，可获得季铵化壳聚糖，如N，N，N-三甲基壳聚糖（N，N，N-trimethyl chitosan，TMC）和羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，HACC）。在季铵化过程中，氨基和羟基中的H 被季铵盐基因的其他基团部分取代获得季铵化壳聚糖衍生物，如N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-HACC）、2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride chitosan，HTCC）、O-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（O-2-HACC）等。由于季铵盐基团具有较强的亲水性，将季铵盐基团引入壳聚糖分子链中，在一定程度上减弱了壳聚糖分子间的氢键，从而增加了壳聚糖衍生物的水溶性，有利于抗原加工和提呈，在疫苗研究领域备受关注。本文就壳聚糖及季铵化壳聚糖作为新型疫苗佐剂的应用前景及最新研究进展作一综述。

1 影响壳聚糖及季铵化壳聚糖佐剂效应的因素

壳聚糖的佐剂效应与其携带的电荷、脱乙酰度、相对分子质量等因素相关，且这些参数对壳聚糖的黏附性、溶解性等生物学效应均有影响［8］。脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基越多，在酸中的溶解性就越好，正电荷量增加。由于细胞表面带有负电荷，二者会产生静电吸引，使其黏附能力增强。有研究表明［9］，中间水平脱乙酰度的壳聚糖能与DNA 药物结合紧密，保护其免于核酸酶降解，形成高稳定性的体内递送复合物。而相对分子质量对于壳聚糖的溶解度及黏附性也有很大作用。相对分子质量越大，分子之间的缠绕程度越大，溶解度越小。一般来说，溶解性越好，诱导的细胞渗透程度越高，更有利于抗原的加工和提呈。有研究发现，与壳聚糖相比，相同相对分子质量的季铵化壳聚糖促进NO 生成方面更加有效，表明季铵盐基团的引入改善了壳聚糖的免疫刺激作用。此外，季铵化壳聚糖刺激产生的NO活性表现出相对分子质量依赖性趋势，相对分子质量高的季铵化壳聚糖显示出较低的NO活性［10］。因此，更强的黏附力在很大程度上需要更高的脱乙酰度和相对分子质量［11］，二者之间具有协同效应。同时，季铵化壳聚糖的季铵化程度（degree of quaternization，DQ）对其佐剂效应也有影响。有研究使用不同DQ（12%～59%）的TMC 探讨DQ 对吸收程度的影响，结果表明，TMC渗透率增强的效果取决于DQ，所有TMC在pH 6.20 时鼻黏膜吸收均增强，DQ 越高，吸收增强越好［12］。QINNA 等［13］发现，41%DQ 和60%DQ 的HACC 水凝胶可显著激活免疫反应。此外，DQ 约为40%的TMC 诱导产生的IgG 和IgA 抗体滴度约为20%DQ 的5.25 倍，其具有鼻腔疫苗佐剂的潜力［14］。因此，具有较好佐剂效应的壳聚糖应选择合适的脱乙酰度、季铵化等参数比例。

2 壳聚糖及季铵化壳聚糖作为佐剂的主要类型

2.1纳米颗粒 纳米颗粒作为疫苗佐剂给药系统有很大优势，具有表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强等特点［15］。壳聚糖纳米颗粒的表面具有大量的亲水离子基团，可延长纳米颗粒在体内的滞留时间，实现缓释和靶向作用［16］。研究发现，利用壳聚糖包封灭活的H1N2 亚型流感病毒形成纳米颗粒，包封率为76%，具有比常规疫苗更长的免疫持续时间，经鼻内免疫猪后，可诱导黏膜和全身免疫反应，IgA 抗体水平与接种可溶性灭活病毒蛋白的猪相比，高5 倍，对其他亚型病毒攻击也有免疫保护作用［17］。虽然壳聚糖存在水溶性较差、不稳定等缺点，但其衍生物季铵化壳聚糖的溶解不受pH 限制，且保留了壳聚糖的优异性能。FARHADIAN 等［18］利用聚合物羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯与TMC 制备纳米颗粒，评估纳米颗粒口服后乙型肝炎表面抗原的释放及其生物活性，结果表明，TMC纳米颗粒在酸性环境中稳定，可保护乙型肝炎表面抗原免受胃酸破坏。同时，基于壳聚糖纳米颗粒可通过被动、主动、刺激响应给药的方法提高其靶向性［19］，控制药物缓慢释放，提高药效，给肿瘤药物靶向治疗带来了希望。

2.2水凝胶 水凝胶是由水溶性单体通过物理或化学方法进行自交联形成的高含水量三维网络结构凝胶，能提供各种治疗药物的持续局部递送［20］。水凝胶药物传递系统可很好地延长药物滞留时间及增强药物穿透性。有研究表明，将H5N1禽流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白与HTCC 水凝胶按照体积比3∶7结合，通过鼻黏膜免疫BALB／c小鼠后，HTCC水凝胶可携带HA在鼻腔中停留6 h，同时还可促进黏膜IgA 免疫，诱导全身体液免疫，增加IgG1和IgG2a 滴度，而单独的HA 约在2 h 内被迅速清除［21］。因此，壳聚糖水凝胶的递送系统可局部传递抗原，提高免疫效率，诱导黏膜免疫。

3 壳聚糖及季铵化壳聚糖作为佐剂在体液免疫和细胞免疫中的作用

3.1壳聚糖激活体液免疫和细胞免疫 在机体免疫反应中，CD4+T 辅助细胞依据产生的细胞因子分化为Th1 和Th2 细胞，且Th1 细胞在抗胞内病毒、细菌及寄生虫等感染中发挥重要作用［22］。研究发现，用N-2-HACC 纳米颗粒包裹灭活的猪细小病毒对母猪进行肌内注射后，血清抗体滴度在6 周后缓慢增加，且免疫后14 周仍维持在高水平，表明N-2-HACC 可激活免疫应答并长期维持较高的抗体水平［23］。同样，PANDEY 等［24］采用离子凝胶法制备壳聚糖纳米颗粒，并将结核分枝杆菌的培养滤液蛋白包裹在内，评估腹腔注射纳米颗粒封装的抗原蛋白对抗结核分枝杆菌气溶胶感染的功效，结果显示，与对照组相比，纳米颗粒免疫的小鼠菌落数量减少95%，表明纳米颗粒具有较好的抗感染作用。有研究证明，HACC和硫酸化壳聚糖用作灭活新城疫疫苗的佐剂，可诱导SPF 级实验鸡产生体液免疫和细胞免疫［25］。进一步证明壳聚糖及其衍生物是一种较强的免疫应答刺激物。

干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）是细胞内DNA 的传感器，可触发Ⅰ型IFN 的产生。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）可参与合成环二核苷酸，其为STING 的活化配体。壳聚糖通过激活cGAS-STING 通路促进细胞免疫。其可通过诱导线粒体损伤，产生活性氧和内源性DNA 的释放，STING 被cGAS 与DNA 结合后激活，与TANK 结合激酶-1（TANK-binding kinase-1，TBK-1）结合，最终分别导致核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）和干扰素调节因子-3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）的激活，从而促进Th1 反应和细胞免疫的产生［26］。同时，NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎性小体也参与了壳聚糖诱导的Th1反应［27］。

3.2壳聚糖激活树突状细胞和巨噬细胞成熟 树突状细胞能高效提呈抗原。其可通过其表面模式识别受体被激活，包括Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）［28］。壳聚糖可激活TLR4 后诱导树突状细胞成熟［29］。通过带正电荷的HACC 和带负电荷的N，O-羧甲基壳聚糖（N，O-carboxymethyl chitosan，NO-CMC）的静电吸引，包裹卵清蛋白，制成纳米颗粒，结果表明，相对分子质量为200 000 的NO-CMC-HACC 纳米颗粒具有70.7%的抗原包封率，与空纳米颗粒相比，NO-CMC-HACC 纳米颗粒处理树突状细胞后，细胞因子表达和分泌量均提高2 ～4倍［30］。有研究用TMC分别包裹流感病毒HA2 蛋白和核蛋白制备纳米颗粒，刺激原代人鼻内上皮细胞，检测其免疫反应，证明纳米颗粒可诱导细胞因子和趋化因子分泌，从而诱导人单核细胞来源的树突状细胞成熟［31］。TMC纳米颗粒为流感疫苗佐剂的开发提供了思路。

巨噬细胞在动物体内参与非特异性免疫和特异性免疫，其主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬和消化，并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，使其对病原体作出反应［32］。ZHANG 等［33］采用壳聚糖酶解法制备了壳寡糖，研究体内外免疫刺激反应及其介导机制，结果表明，壳寡糖显著增强Raw264.7 巨噬细胞增殖，刺激促炎细胞因子NO 和TNF-α 分泌，且刺激作用是通过TLR4 介导的。同样，HACC 对巨噬细胞也具有免疫刺激作用，导致TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子的释放。但其激活机制不同，HACC 主要通过JAK-STAT 信号通路和MAPK通路激活Raw264.7细胞［10］。

4 壳聚糖及季铵化壳聚糖作为佐剂在黏膜免疫中的作用

黏膜免疫系统是人体免疫系统中的重要组成部分，也是抵抗感染的第一道防线，可引起黏膜局部反应和全身免疫应答。对于呼吸道感染疾病来说，是一个有效的预防屏障。壳聚糖作为黏膜佐剂有很大潜力，与其具有黏附性以及使细胞紧密结合的蛋白发生结构改变，开放跨膜通道，“打开”细胞之间的紧密连接有关。有研究表明，壳聚糖的黏附性可使其在免疫部位的滞留时间延长，且在鼻腔中降解较慢，保证了给药的壳聚糖不会被黏液纤毛运动清除［34］。此外，通过结肠癌细胞Caco-2 单分子层模型验证了含卵清蛋白的壳聚糖纳米颗粒可“打开”上皮细胞之间紧密连接的能力［35］，同时也可增强抗原渗透性［36］。ZHANG 等［37］制备了包裹卵清蛋白的硫酸凝胶多糖-O-（2-羟基）丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖纳米颗粒，对小鼠进行鼻内免疫，结果显示，卵清蛋白易被上皮吸收，且诱导阴道灌洗液中sIgA 的分泌，表明纳米颗粒可引起远端黏膜的免疫应答，壳聚糖可能作为有效的黏膜佐剂。

相比传统的疫苗接种途径，通过黏膜途径接种有很大优势：在黏膜部位会产生额外的sIgA 抗体来保护机体；易给药，同时减轻接种疫苗给儿童造成的恐惧［38］；针对免疫力低下的老年人，也保证了其安全性［31］。黏膜免疫最主要的途径是鼻黏膜，其次是胃肠道。壳聚糖及其衍生物由于独特的优势作为黏膜佐剂被广泛研究［39］。纳米颗粒作为抗原递送系统具有在局部淋巴结捕获和保留抗原的能力，由于其携带正电荷，易被抗原提呈细胞识别并吞噬，从而产生体液免疫和细胞免疫反应，同时，将抗原配制成纳米颗粒可使其免受胃肠道黏膜水解酶或低pH 的影响，从而有效解决了黏膜免疫过程中存在的障碍［40］。

有研究发现，以N-2-HACC和NO-CMC 纳米颗粒为递送载体的新城疫病毒DNA 疫苗经鼻内免疫鸡后产生的IgG 和sIgA 抗体水平比免疫PBS 缓冲液阴性对照组的鸡高4 倍，且刺激淋巴细胞增殖，诱发了较高水平的IL-2、IL-4和IFNγ［41］。HAHAM 等［42］以壳聚糖纳米颗粒包裹HA2、M2emRNA 为核，HA2、M2e蛋白质为壳共同使用模拟流感病毒的结构，经鼻给药检测其保护性，结果显示，该壳聚糖纳米颗粒极易被抗原提呈细胞识别，并能有效穿透黏膜屏障到达黏膜相关淋巴组织，刺激机体产生局部黏膜免疫反应和细胞免疫反应。因此，壳聚糖是通过鼻腔给药诱导黏膜免疫应答的有前景的佐剂。

5 小结及展望

壳聚糖具有价格低廉、生物相容性好、黏附性强、安全性高、缓释等优点，可减少抗原用量，延缓抗原释放，诱导黏膜免疫应答，是理想的黏膜佐剂。壳聚糖通过一些化学修饰与纳米技术结合，增强其在疫苗佐剂中的应用。但壳聚糖及季铵化壳聚糖的相关研究目前多处于实验室阶段，一些关键问题尚待解决，如壳聚糖及季铵化壳聚糖在化学改性中如何确保批次间的一致性，如何确定纳米颗粒和水凝胶两种佐剂形式在制备过程中是否具有潜在毒性以及在临床应用中的剂量，壳聚糖及季铵化壳聚糖在体内发挥局部和全身免疫反应的作用机制、转运机制尚不明确。气凝胶是由含高化学活性组分的化合物制备成凝胶，再采用一定的干燥方式使气体取代凝胶中的液体而形成的一种纳米级多孔固态材料，可作为药物递送系统，可增加载药量和药物的溶解度，控制释放，且不会影响药物生物活性，因此，其具有作为疫苗佐剂的潜质。随着研究的深入，壳聚糖气凝胶与蛋白质和多肽类物质的结合有望在疫苗佐剂方面提供新的应用可能性，壳聚糖及季铵化壳聚糖有望成为一种有发展潜力的新型免疫佐剂。