多花指甲兰开花特性与繁育系统研究

郑棚汭，董春燕，陈之光,，徐 言，葛 红，杨树华，赵 鑫，寇亚平，朱晋宇，贾瑞冬，武荣花

（1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002；2.青州市亚泰农业科技有限公司，山东 青州 262501；3.中国农业科学院 蔬菜花卉研究所 蔬菜生物育种全国重点实验室/农业农村部花卉生物学与种质创制重点实验室 (北方)，北京 100081）

指甲兰属Aerides是兰科Orchidaceae 重要的观赏植物及药用植物，属下有30 种，主要分布在印度、斯里兰卡、尼泊尔、不丹、缅甸、越南、老挝、泰国、马来西亚、菲律宾、印度尼西亚、巴布新几内亚，及中国南方亚热带区域[1]。中国共有多花指甲兰A.rosea、香花指甲兰A.odorata、小蓝指甲兰A.orthocentra、扇唇指甲兰A.flabellate和指甲兰A.flacata等5 种。指甲兰属为单轴分枝类兰花，与蝴蝶兰属Phalaenopsis、万代兰属Vanda、钻喙兰属Rhynchostylis等关系较近，都属于树兰亚科Epidendroideae 万代兰族Vandeae 指甲兰亚族Aeridinae，属间杂交亲和，可培育新品种[2]。据英国皇家园艺学会兰科登陆机构(RHS)记载，蝴蝶兰属与指甲兰属的远缘杂交种已有20 余个。

多花指甲兰原生境花期为5—7 月，果期为8 月至次年5 月，产于中国广西、贵州、云南，在不丹、印度、缅甸、老挝和越南也有分布，生于海拔320～1 530 m 的山地林缘或山坡疏生的常绿阔叶林树干上。被《中国物种红色名录》记为极危(CR)；被《中国生物多样性红色名录：高等植物卷》记为濒危(EN)。花色粉嫩、花量大、花型奇特、花香馥郁，是观赏价值极高的兰花，也可与蝴蝶兰进行远缘杂交，培育有香味的蝴蝶兰。

目前，对于多花指甲兰的研究较少，主要在组织培养、非共生萌发技术[3]、功能性成分分析[4]等方面。王清芸等[5]对其花粉活力和柱头可授性研究发现：开花6 d 时的花粉活力最强，盛花期柱头可授性最高，但对其开花进程及繁育系统未进行系统研究。开展花部特征和繁育系统研究，不仅可以深入研究花朵的结构、传粉方式和媒介种类，还能够了解植物的生态适应机制，为杂交育种工作提供依据。以往兰科植物繁育系统研究[6-13]为本研究提供了参考。观察多花指甲兰开花进程，并进行繁育系统研究，可为该物种种质资源的保护提供有力保障，也为实现多花指甲兰的人工繁殖和产业化生产，及远缘杂交育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与样地

多花指甲兰种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室，该温室春秋季常开天窗；夏季开风机，水帘降温；冬季有暖气供暖。室温保持在26～30 ℃，相对湿度为65%～70%。取200 株生长状况良好、无病虫害的5 年生多花指甲兰进行试验。

1.2 研究方法

1.2.1 花器官特征和开花进程观测 随机选取盛花期全天开放的植株10 株，测量株高、花序长、中萼片、侧萼片、花瓣、唇瓣、花序、花朵数及叶片数。按照DAFNI[14]的标准，选取10 株植株进行开花进程观察，观察记录群体水平(群体内第1 朵花至最后1 朵花开放的日期)、单株水平(单株上第1 朵花开放至最后1 朵花凋谢的日期)、单花水平的开花进程(单朵花花瓣从两侧打开至花朵枯黄脱落的日期)。

1.2.2 电镜扫描和花粉活力测定 选取初花期和末花期的花粉团，经配置的FAA 固定液(100 mL FAA 中含体积分数为50%的乙醇89 mL、冰乙酸6 mL、甲醛5 mL)处理24 h 后，用乙醇溶液按梯度(体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%)脱水15 min，放入加有干燥剂的1.5 mL 离心管中，用CO2临界点干燥仪(Leica CPD 300)干燥5 h，用双面胶将干燥后的植物样品粘在金属台上，待观察部位朝上。离子溅射仪(Hitachi E-1010)对金属台喷金、镀膜。在扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)下观察和测量花粉团的表面纹饰、花粉外形态，并拍照。

筛选测定多花指甲兰花粉活力最适宜的方法：①醋酸洋红染色法。于每日9:00—10:00 采集多花指甲兰各生长阶段的新鲜花粉，将花粉置于载玻片上，用解剖针将花粉团轻轻捣碎，滴入1～2 滴的醋酸洋红染液后轻轻将其均匀分散开，盖上盖玻片，每次制片3 张。静置10～15 min后，于倒置显微镜(Olympus BX53)下观察，选取6 个不同视野进行拍照。花粉活力强的花粉会被染成红色，较淡的颜色被视为活力较弱。②氯化三苯四氮唑(质量浓度为1%的TTC)染色法。参照边子星[15]的方法：将新鲜的花粉置于2 mL 的试管中，用解剖针将其轻轻捣碎，后滴入1 滴质量浓度为1%的TTC 染色液，黑暗培养24 h。摇晃试管，使得花粉分散均匀，用移液枪吸取含有花粉的TTC 染液，置于载玻片上，用解剖针轻轻将花粉细胞均匀分散开，制片3 张。放至倒置显微镜(Olympus BX53)下进行观察并拍照，选取6 个不同的视野。以花粉细胞被染成红色为活力较强标准，白色为活力较弱标准。③花粉离体萌发法。参照欧阳英等[16]的方法：以质量浓度为5.000%蔗糖+质量浓度为0.050%硼酸+质量浓度为0.001%氯化钙+体积分数为5.000%椰汁为液体培养基。将花粉用解剖针取下置于双面凹载玻片上并散开，用滴管吸取上述培养液滴入含花粉的凹面里，后将载玻片放于垫有3～5 张湿润滤纸的培养皿中，盖上盖子置于组培室(室内温度25 ℃，相对湿度80%以上)培养48 h 后统计花粉萌发数。以花粉管长度超过花粉直径的2 倍记为萌发。每阶段取3 份样，制片后随机选取3 个视野统计萌发数，重复3 次。花粉萌发率=萌发的花粉数/视野内总花粉数×100%。

1.2.3 柱头可授性测定 采用联苯胺-过氧化氢法[V(质量浓度为1%联苯胺)∶V(体积分数为3%过氧化氢)∶V(水)=4∶11∶22]测定各阶段柱头的可授性。用体视显微镜(Olympus SZ)观察并拍照。柱头周围反应液伴有大量的气泡产生表示柱头具有可授性，气泡越多表示可授性越强。

1.2.4 花粉组织化学 随机采取多花指甲兰成熟的花粉团，将其放置载玻片上碾碎，滴入碘-碘化钾浸染15 min，放置在倒置显微镜(Olympus BX53)下观察，花粉若经碘-碘化钾处理后显示红色说明花粉有脂质存在，处理后若呈蓝色或黑色则说明花粉有淀粉存在。

1.2.5 杂交指数(OCI)估算 根据DAFNI[14]的标准计算OCI 值。花朵直径＜1 mm 记为0；1～2 mm 记为1；2～6 mm 记为2；＞6 mm 则记为3。花药与柱头的空间位置在同一高度记为0，空间分离记为1。花药开裂时间和柱头可授粉期同步或雌蕊先熟记为0，雄蕊先熟记为1。三者之和为OCI。繁育系统的评判标准：OCI=0，为闭花受精；OCI=1，为专性自交；OCI=3，为自交亲和，有时需要传粉者；OCI≥4，为部分自交亲和，异交，需要传粉者。

1.2.6 人工控制授粉 随机选取初花Ⅱ期花朵进行人工控制授粉试验，设置6 个处理(不去雄不套袋不授粉、不去雄套袋不授粉、去雄不授粉、人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉)，检测多花指甲兰传粉方式。每个处理重复3 次，共计20～30 朵花。授粉30 d 后统计结实率。结实率＝结实数/授粉数×100%。

1.2.7 数据分析 利用Excel 2016 进行表格绘制，SPSS 25.0 进行数据处理、标准误计算及显著性分析(单因素方差分析、邓肯法)，Photoshop 2021 进行图片制作。

2 结果和分析

2.1 花器官特征

由图1 可见：多花指甲兰有1～4 个花梗，其总状花序长10～30 cm，花序形态似“狐尾”。茎粗壮，长约5～20 cm，花序叶腋生，花序轴较长，密生数十至近百朵花；花由1 个中萼片、2 个侧萼片、2 个花瓣和1 个唇瓣组成。子房棒状带纵棱，花梗和子房白色带淡紫色晕；中萼片和侧萼片呈卵圆形，花瓣披针形，花瓣与中萼片有粉紫色斑点。唇瓣上密布紫红色斑点，边缘稍具不整齐的锯齿。表1 为多花指甲兰株高、最大叶长宽、花序长、中萼片和侧萼片的长宽、花瓣长宽及唇瓣的横纵径等花部表型性状。

表1 多花指甲兰表型性状Table 1 Phenotype of the A.rosea

图1 多花指甲兰的花器官特征Figure 1 Floral syndrome of A.rosea

通过电子扫描显微镜观察(图2)可见：多花指甲兰在开花1～2 d 花粉团比末花期花粉团更加饱满(图2A 和B)。花粉团表面不平整，有极多凸起，由数万个花粉细胞紧密聚集而形成(图2C)，花粉粒类球形(图2D)，直径约200 μm。

图2 多花指甲兰花粉电镜扫描Figure 2 Floral syndrome of A.rosea

2.2 开花进程

温室内，多花指甲兰在5 月底零星开放，群体花期为5—7 月，单花花期7～10 d，单株花期15 d。总状花序，花序的花朵从下至上开放，花序上第1 朵花开放至整个花序的花全部开放约需10 d。按DAFNI[14]的标准将多花指甲兰的发育分为7 个阶段(图3)。①花蕾Ⅰ期(开花前4～5 d)。花蕾未开放，呈不规则椭圆形，中萼片和唇瓣紧闭，可见距。②花蕾Ⅱ期(开花前1～3 d)。花蕾开始开放，中萼片和唇瓣开始分离，有紫色的花瓣露出。③初花Ⅰ期(开花1～2 d)。花蕾开始开放，唇瓣与花瓣分离，横径距离1.5 cm，柱头有黏液分泌。④初花Ⅱ期(开花3～4 d)。花蕾大部分开放，萼片微微卷曲，唇瓣向下竖起，花瓣和唇瓣纵径距离大于3.0 cm，能明显看到合蕊柱，柱头黏液量分泌达到最高。⑤盛花期(开花5～6 d)。花朵完全开放，花瓣完全打开，花粉团由鹅黄变成深黄。⑥末花期(开花7～8 d)。花朵枯萎，萼片卷曲，唇瓣凹陷，萼片和唇瓣的颜色变褐色。⑦凋谢期(开花9～10 d)。花朵完全失去水分，整体呈现褐色，花粉团变硬，花朵枯萎。

图3 不同发育阶段的多花指甲兰Figure 3 Different development stages of A.rosea

2.3 花粉活力与柱头可授性

由图4 可知：相对于醋酸洋红染色法，TTC 染色法可明显区分有活性花粉，且TTC 染色法所测得的结果略高于醋酸洋红染液测定的活力，花粉离体萌发法不能准确测定多花指甲兰花粉活力，其花粉管杂乱无章不易查数。因此选用TTC 染色法测定多花指甲兰各时期花粉活力，由表2 可以看出在盛花期花粉活力最高，可达74.57%，其次为初花Ⅱ期。

表2 花粉活力与柱头可授性检测Table 2 Test of pollen viability and stigma acceptability

图4 不同方法测定花粉活力Figure 4 Pollen viability determined by different methods

在对柱头可授性进行检测时发现(图5)：在初花Ⅱ期和盛花期时柱头周围有大量的气泡产生，说明此阶段的可授性最强。故对多花指甲兰进行人工授粉时，应选择初花Ⅱ期或盛花期，盛花期授粉效率最高。授粉时，先将花粉用镊子取出，此时花粉团具有很强的黏性，易黏在柱头腔内，授粉成功后，通常在1 周后即可看到子房开始膨大。

图5 不同时期柱头可授性Figure 5 Stigma accessibility test

2.4 花粉组织学

经碘-碘化钾对多花指甲兰的花粉进行染色后，在显微镜下可看到花粉会被染成红色(图6)，表明多花指甲兰花粉中淀粉较少，脂质较多。以往研究表明[17]：兰科植物的花粉含有脂类，一般以花蜜和油类较多[18]，而淀粉并不是经常存在，这与系统发育有关。有推断，脂质花粉营养丰富，更容易吸引昆虫进行传粉，而淀粉花粉有利于风媒传粉。

图6 碘-碘化钾花粉组织染色Figure 6 Staining of iodide-potassium iodide pollen tissue

2.5 杂交指数(OCI)

多花指甲兰花朵直径为2.5～3.6 cm，大于6 mm，分值为3；花粉成熟时聚成典型花粉团位于柱头上方，两者存在一定距离，无法接触，且花粉与柱头腔间的蕊喙发育，阻止自交授粉发生，分值为1；花粉和柱头同步成熟，分值为0。多花指甲兰的OCI 为4，其繁育系统以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者。

2.6 人工控制授粉

成功授粉后的花朵，5 d 后可见柱头微微膨大，花瓣、唇瓣与萼片开始枯萎脱落；10 d 左右子房膨大。授粉未成功的花朵在开花7 d 左右花瓣开始枯黄，萎缩，约10 d 后连同子房一起脱落。授粉成功的花朵比未授粉的花朵先枯萎。授粉30 d 后统计果荚结实情况(表3)可知：多花指甲兰无论是否去雄、套袋，不进行人工授粉的结实率均为0，而人工自花授粉、人工同株异花授粉、人工异株授粉的结实率分别为85.71%、88.00%、84.00%，无显著差异。这表明多花指甲兰需要借助传粉媒介进行传粉，不存在自然自花授粉和无融合生殖现象。

表3 不同处理下结实率Table 3 Percentage of fertile fruit in different pollination treatments

3 讨论

多花指甲兰有2 枚侧萼片、1 枚中萼片、2 枚花瓣和1 枚唇瓣，具有较高的观赏价值，是蝴蝶兰属不可多得的香花远缘杂交亲本。多花指甲兰的花期在5—7 月，总状花序，开花时有香味，花自下而上循序开放，但时间差别不大。单株有1～4 个花梗，数十朵花。单朵花自然状态下花期为7～10 d，整株花期约15 d。而王清芸等[5]对种植于云南省的多花指甲兰观察，发现其整株花期仅有10 d，说明温室栽培条件相比于露地条件，更适合多花指甲兰生长，可延长其花期。

花粉活力是决定授粉成功与否的关键，花粉活力的高低及柱头可授性的强弱与花朵开放时间有关。多花指甲兰的花粉为四分体结构，花粉进行离体萌发培养时，花粉团在培养液中自然散开，四合花粉粒均保持完整的膜结构，能够萌发，但经过物理碾压，花粉粒的膜结构易遭到破坏，对花粉粒的萌发造成一定的影响，从而加大记数时的误差，所以当尝试用花粉萌发法测定花粉活性，统计数据结果活性偏低，因此本研究并未采用花粉离体萌发法测定数据。本研究也比较了TTC 和醋酸洋红2 种染色液对多花指甲兰有活力花粉的染色状况。结果表明：2 种染色液测定的花粉活力均随着花朵开放时间延长，呈先上升后下降的趋势，与其他兰花结果一致[12,19]。但是TTC 所测花粉活力略高于醋酸洋红，可见在温室条件下栽培的多花指甲兰更适合用TTC 染色法测定花粉活力。采用联苯胺-过氧化氢法是检测柱头可授性较为简单常用的方法[20-22]，多花指甲兰同样适用此方法。开花时间的长短影响着柱头可授性的强弱，多花指甲兰在初花Ⅱ期和盛花期可授性达到最高强度，之后又逐步降低。多花指甲兰花粉与柱头同熟，在初花Ⅱ期和盛花期花粉活力与柱头的可授性都较强，因此，此时期开展授粉工作成功率最高。

植物的繁育系统是判断其种群能否延续的重要体系标准，通常是指对直接影响后代遗传组成的所有有性特征进行研究，人工授粉是最基本的研究方法。在对多花指甲兰进行人工控制授粉试验中，不去雄且不套袋、不去雄且套袋以及去雄不授粉的结实率均为0，但是人工自花授粉、人工同株异花授粉及人工异株授粉后，都有80%以上结实率。这些结果皆表明多花指甲兰有高度的自交和异交的能力。根据DANFI[14]的标准所得出的杂交指数也表明：多花指甲兰为自交和异交的混合交配模式，需要特定的传粉者。根据花粉组织化学染色结果表明：多花指甲兰花粉脂质含量较多，初步判断为虫媒传粉，但仍需后期野外验证。基于多花指甲兰繁育系统研究的结果，本研究在初花Ⅱ期和盛花期进行人工授粉，已经获得大量种苗。今后将在自然条件下对其进行人工授粉，提高繁殖效率，从而最大限度地保护多花指甲兰的种质资源。

4 结论

多花指甲兰为总状花序，单花花期7～10 d，群体花期为5 月初至7 月底，开放时有香味。雌雄同株，且同步成熟，在盛花期(开花5～6 d)花粉活力与柱头可授性均达到最强，花粉活力高达74.57%。多花指甲兰花粉为近圆形四合花粉，主要由脂质组成。OCI 为4，多花指甲兰不存在无融合生殖现象，繁育系统是需要传粉者传粉的自交和异交混合交配模式。