循环肿瘤DNA的检测技术及在癌症诊疗中的应用价值*

张洁洁 牛春艳 董莲华 杨怡 李会杰 杨靖亚

（1）上海海洋大学食品学院，上海 201306；2）中国计量科学研究院前沿中心，北京 100029）

肿瘤是目前全球卫生保健问题日益严重的因素之一，每年有超过百万的新确诊患者。它是由相关基因功能紊乱引起的遗传变化导致的多基因疾病，有较高的发病率和死亡率［1］。目前，组织活检是临床上最常用的诊断癌症手段，被广泛用于表征肿瘤类型。然而，组织活检是一种侵入式取样方式，在取样过程中很有可能因为组织本身的异质性或没有在病变位置采样而引起癌症错判［2-4］。除此之外，还会由于活检本身不能反复取样的特性而不能对肿瘤进行实时监控。所以组织活检技术在操作成本、诊断精确性，以及癌症的高效治疗方面仍然面临更多的挑战。为了克服以上问题，有研究人员开发一种新型的非侵入式检测方式，称其为液体活检［5-7］。该检测是基于对循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA［8］）、循环肿瘤细胞［9］和血浆中其他肿瘤衍生物质［10］的分析。它们来源于肿瘤组织，存在于血液中，可以反映肿瘤发展进程以及耐药性等信息，指导个体化精准治疗。液体活检中对ctDNA的检测可以发现单核苷酸变异、拷贝数变异［11-12］、甲基化［13］等多种表观遗传学改变。它携带肿瘤组织的信息密码，是一种很好的肿瘤检测生物标志物，在肿瘤检测方面有较高的准确性和安全性，所以备受关注并被广泛研究。

1 ctDNA来源及性质

ctDNA是来源于肿瘤组织的一种循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA），通过肿瘤细胞的凋亡、坏死和分泌外泌体释放到血液中。Mandel等［14］在1948年首次发现cfDNA存在于健康人的血液中。研究显示，在健康个体血浆中cfDNA浓度约为1~10 μg/L［15］。但是在运动、急性创伤、移植、感染后cfDNA的浓度会升高，这一特征为其成为潜在的生物标志物奠定了基础。1989年Stroun等［16］发现，在肿瘤患者血浆中的部分cfDNA来自于肿瘤细胞，因为它具有肿瘤DNA特有的双链不稳定性。1994年Sorenson等［17］首次报道用等位基因特异性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法在胰腺癌患者血浆中发现的KRAS突变与在肿瘤中发现的KRAS突变相同，从而证实了血浆中突变的DNA片段是肿瘤起源，于是就产生了ctDNA这个术语。患者血液中ctDNA的存在及其水平的变化与肿瘤负荷和肿瘤进展有关，并且ctDNA已被证实存在于多种实体恶性肿瘤患者中（如肺癌［18］、结直肠癌［19］、乳腺癌［20］、黑色素瘤［21］、前列腺癌［22］、胃癌［23］等）。

基于细胞不同的死亡机制，ctDNA的长度具有可变性，来自坏死细胞的ctDNA片段长度可能超过10 000 bp，而来自凋亡细胞的ctDNA片段长度一般为180 bp左右（以及180 bp的倍数）［15，24］，这可能与核小体有关。近年来基于测序的方法检测cfDNA时通常在166 bp［25-26］处识别出一个显著的峰，这是包裹在核小体周围的DNA长度（147 bp）加上与组蛋白相关的连接子DNA的长度。但是，有研究表明，ctDNA的片段长度比非癌症突变的cfDNA要短20~40 bp，在大鼠移植模型中，ctDNA片段长度在134~144 bp，造成这种截短的原因尚不明确［27］。An等［28］发现，cfDNA片段化过程受到DNA甲基化的调控，DNA甲基化可影响核酸酶的结合以及切割位点，从而决定cfDNA片段化的模式。低水平的DNA甲基化可以增加核小体的可及性，并改变DNA片段化过程中核酸酶的切割活性，从而进一步导致cfDNA切割位点和大小分布的变化。

ctDNA的半衰期较短，约15 min~2 h［29-31］，被核酸酶水解进入循环系统，并由肾脏排泄到尿液中。因此，ctDNA可以作为肿瘤动态的高度特异性标志物，对肿瘤的进程和术后反应进行实时监测，ctDNA的分析与检测开启了肿瘤进展过程中无创检测特定癌症突变的可能性。

2 ctDNA样品处理

由于片段小、容易丢失和降解，所以从血液中分离ctDNA进行定量是具有挑战性的。虽然ctDNA的浓度会随着分期和肿瘤大小的增加而提高，但是ctDNA在血液中的总百分比极低，这对样品处理过程提出了更高要求［32］。

首先在样品采集方面，为了避免由于细胞裂解和血液凝固过程中DNA的释放造成ctDNA的稀释，最好用血浆来提取ctDNA［33-34］。血浆样品也不能储存过长时间，研究显示-80℃保存的血浆中的DNA水平每年下降30%［35］。另外抗凝剂管的选择也很关键，Wong等［36］通过对孕妇血浆中循环游离胎儿DNA分子分析，调查和验证了进行无创产前检查的血液运输和储存条件。结果显示，相比于EDTA抗凝管，Streck BCT抗凝管能够最大限度地减少细胞降解。

其次在样品提取方面，Fong等［37］比较了不同的cfDNA提取方法（苯酚-氯仿法、碘化钠法、QIAamp DNA试剂盒等），发现碘化钠方法的得率最高。为了排除由于DNA提取物中存在各种PCR抑制剂而导致扩增结果错误，可以用亚硫酸盐转化去除PCR抑制成分（蛋白质、EDTA和乙醇等）［38］，从而提高检测效率。

3 ctDNA检测技术

近年来，分子生物学技术正在迅速发展，促进了ctDNA的研究与检测［39］。目前ctDNA的主要检测方法一类是基于PCR的方法，包括实时荧光定量PCR（real-time fluorogenic quantitative PCR）、数字PCR（digital PCR，dPCR）、BEAMing（beads，emulsion，amplification，and magnetics）、ARMS-PCR（amplification-refractory mutation system PCR），另一类是基于下一代测序（nextgeneration sequencing，NGS）方法。除此之外，一些新技术，特别是基于纳米技术的生物传感器在检测ctDNA方面具有巨大潜力，为低成本临床应用提供了一种简单而高性能的通用策略。主要有电化学生物传感器、荧光生物传感器、表面增强拉曼散射生物传感器、比色/共振光散射生物传感器等（图1，表1）。

Table 1 Comparison of ctDNA detection techniques表1 循环肿瘤DNA检测技术对比

Fig.1 Flowchart of the principle of the main detection methods for ctDNA图1 循环肿瘤DNA主要检测方法的原理流程图

3.1 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是检测ctDNA最常用的技术之一，可以对其进行相对定量，具有操作简单、灵敏度高、特异性好等特点。然而，实时荧光定量PCR对反应中目标序列的“绝对”量是相对于从已知数量或拷贝数的样品生成的标准曲线进行校准［40-41］。Fleischhacker等［42］使用3种不同的参考基因（GAPDH、β-globin、ERV）通过实时荧光定量PCR对血浆中的ctDNA进行检测，结果β-globin与另外两种参考基因的检测结果有很大差异。对于用实时荧光定量PCR技术进行ctDNA定量分析，拥有统一且稳定的参考基因和已知拷贝数的ctDNA标准物质是问题的关键。

3.2 dPCR

dPCR是被称为能够对样品中存在的目标核酸进行绝对定量的第三代PCR技术［43］。在dPCR中，首先将样品分为许多独立的PCR反应单元，使得每个微小单元中包一个目标序列或不包含目标序列。众多的微小单元在相同的条件下进行PCR扩增，扩增结束以后，可以统计发出荧光信号的单元个数占总微滴个数的比例，通过泊松分布计算目标序列的浓度和绝对数目。并且目标序列集中在分离的微小单元里，这种浓度效应减少了模板竞争，从而能够在野生型序列的背景下检测罕见的突变。根据形成微小单元的不同原理，数字PCR又可以分为芯片式数字PCR和微滴式数字PCR。

液滴式数字PCR能产生体积达20 000 nl的油包水液滴，这些液滴同时进行PCR扩增，然后用荧光探测器对这些液滴进行分析，可以实现对相对较低浓度的样本进行绝对定量，比如对ctDNA基因突变检出限可以低至0.01%［44-45］，并且能够同时检测多种靶标。Guo等［46］评估了dPCR对ctDNA样本EGFR基因3种突变类型（E746-A750del、L858R和T790M）的检测性能，检测特异性为100%，检出限分别为0.05%、0.05%和0.1%。De kock等［45］同时检测了EGFR突变中的19DEL、L858R、L861Q、G719S、S768I等常见突变，当ctDNA的输入量为10 ng时，这些基因的检出限分别为5%、1%、0.25%、0.1%和0.01%。dPCR由于可以对目标基因进行绝对定量并且检测限极低已被广泛应用，但是其通量低且只能检测已知点突变。

3.3 BEAMing

BEAMing是指集合微珠、乳液、扩增、磁性，可以来测量突变型基因和野生型基因的技术［47］。该技术制造出几百万个油包水乳浊液小泡，每个乳浊液小泡中，有一个小的磁珠，通过磁珠上包被基因特异的引物来扩增目的序列，每个磁珠包含原始DNA分子序列的数千个拷贝。然后可以利用荧光探针与磁珠上的DNA片段进行杂交，并使用流式细胞术计数来评估群体中变异DNA分子的数量。Janku等［48］证明了使用BEAMing技术检测癌症晚期患者血浆ctDNA中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因的21个致癌突变是可行的，其结果与组织活检有较高的一致性（BRAF，91%；EGFR，99%；KRAS，83%；PIK3CA，91%）。Higgins等［49］使用BEAMing评估了同时获得的晚期乳腺癌患者的血浆和肿瘤组织样本，二者之间PIK3CA突变有100%的一致性。BEAMing技术的优点一是能够分析ctDNA分子中的微小变异，其突变等位基因频率的检出限约为0.02%，二是代表突变等位基因的稀有磁珠不仅可以定量，还可以纯化以供后续分析。

3.4 ARMS-PCR

ARMS-PCR［50］指扩增受阻突变体系，又称为等位基因特异性扩增法，是一种简单而经济的SNP基因分型方法，包括PCR反应及凝胶电泳。使用特殊的两组引物在PCR反应中分别扩增已知点突变的模板和正常的模板，然后与微孔板阵列对角线凝胶电泳技术相结合，可以将点突变的模板与正常模板区分开。Xu等［51］评估了ARMS-PCR检测非小细胞肺癌患者（non-samll cell lung cancer，NSCLC）的EGFRT790M突变的敏感性和特异性。结果显示该方法敏感特异性强、成本低、操作简单。但是这种方法的引物设计部分关键且耗时，而且需要借助专门的引物设计计算机程序。

3.5 NGS

NGS被称为二代测序技术，是将DNA随机片段化、加接头、制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应，然后通过检测信号，而得到序列信息的技术［52］。因其具有据有高通量的优势，可以检测多个已知或未知的点突变，被广泛应用于ctDNA的检测［53-54］。

由NGS衍生出了不同的测序类型，包括全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、标记扩增子深度测序（Tam-Seq）、肿瘤个性化深度测序（CAPP-Seq）等。WGS能提供完整的罕见肿瘤基因组信息，在协助罕见基因突变的临床决策和治疗方案的选择方面显示出巨大的潜力［55］，但由于昂贵且耗时以及一些伦理问题限制了它在临床中的应用。WES测序可用于对人类基因组编码区进行测序，以检测常见或罕见疾病的相关突变。与传统测序技术相比，有成本低、速度快的优势［56］。Tam-Seq能够同时对数百万个DNA分子进行测序，从而能够对一个物种的转录本和基因组进行详细分析，其通量高、成本低、测序时间短［47］。CAPPSeq可以识别同类型癌症患者的多重突变，改善肿瘤异质性的评估，从而提供更全面的诊断信息［55，57］。

3.6 生物传感器

PCR和测序的方法使ctDNA检测取得了重大进展，使用少量的起始材料并提供高灵敏度和特异性。然而一些关键点限制了它们的应用，以及在临床环境中的开发：测序的方法操作复杂且过于昂贵，PCR法容易受到序列特异性扩增的影响，并且需要样品预处理，从而增加了分析成本和时间成本。因此，研究者开发了适合临床常规使用的低成本和便携式平台［58］，通过简单的操作过程，能够准确检测未经处理的血清或血浆中的特定ctDNA突变。

3.6.1 电化学生物传感器

Cai等［59］报道了一种基于肽核酸探针-金纳米颗粒和磷酸铅载铁蛋白的双生物标志物检测平台，用于检测ctDNA中PIK3CA基因甲基化和肿瘤特异性突变。肽核酸探针和抗5甲基胞嘧啶抗体用于识别ctDNA的不同部分，在电极表面上形成三明治结构。通过方波伏安法检测电极上的载铁蛋白释放的铅离子电化学信号，从而实现对ctDNA高度特异性和灵敏性检测。该传感器可以对ctDNA浓度产生50~10 000 fmol/L的线性电流响应，检出限为10 fmol/L，并成功检测出从癌症患者血清中收集的ctDNA。

3.6.2 荧光生物传感器

Li等［60］开发了一种基于杂交链式反应和邻位连接调控CRISPR-Cas12a系统的ctDNA灵敏检测双信号扩增策略。CRISPR-Cas系统除了非凡的基因编辑能力外，还具有等温信号放大的作用，开启了生物传感应用的新时代。ctDNA通过两个发夹探针的连续杂交启动杂交链式反应，产生许多带切口的双链DNA纳米片段，这些片段继续连接来激活CRISPR-Cas12a的反式切割活性。在这种情况下，可以切割双标记的单链DNA荧光基团以产生强烈的荧光信号。由于杂交链式反应和CRISPR-Cas12a的双重扩增，该方法对ctDNA表现出高灵敏度，检出限低至5.43 fmol/L。

4 ctDNA标准物质在NGS中的重要性

NGS的应用越来越广泛，有望成为实现人类癌症基因组医学的有用工具。然而，其临床应用的前提是需要确保数据的可靠性和准确性。应用NGS进行基因突变检测包括样品制备、核酸提取、文库制备以及序列测定、数据分析等多个步骤，因此确保所有步骤的有效性面临极大挑战［61］。已知浓度和突变丰度的ctDNA标准物质可用于校准NGS测量和评估诊断性能，通过ctDNA标准物质产生的标准数据集可对二代测序各个过程进行质量控制。因此，提倡使用标准物质验证整个诊断系统［62］。

ctDNA标准物质对ctDNA分析性能全面评估起着关键作用。已知序列的合成DNA可用作验证DNA测序的标准［63］，但理想情况是使用更接近真实临床样本的病理标本，以验证包括样本制备在内的整个诊断过程［64］。当待测基因数量较少时，可以保存一部分临床标本并作为特定基因的标准物质，但为多基因检测的测序方法中所有基因制备此类标准物质仍存在一定困难。此外，对于某些遗传疾病，由于突变的罕见性，很难获得真实的临床样本。用已突变细胞系作为原料制备ctDNA标准物质比合成DNA更接近临床样品，更易获得且可以保持稳定供应，因此可以用于制备均匀稳定的标准物质，对NGS检测过程进行验证和评估［65-66］。

目前国内外利用标准物质开展对ctDNA分析方法进行性能评估的研究还较少。2021年由美国食品药品监督管理局（FDA）牵头的一项研究［52］报告了对业界领先的5种ctDNA测序分析方法的多位点、跨平台分析性能评估结果。该研究使用标准化的来源于细胞系的标准物质对ctDNA测序工作流程的每个阶段进行了评估及验证。研究结果表明，样本突变频率、覆盖深度和异质性、DNA样本量、外显子边缘效应等因素是测序流程中重要的影响因素，当等位基因突变频率高于0.5%时，5种测序检测方法均能以较高的灵敏度、准确性和重复性检测到ctDNA突变，但低于这一范围时，检测就变得不可靠，不同检测方法之间的差异很大。这种对ctDNA分析性能的全面评估有助于为最佳实践指南提供参考。

5 ctDNA在癌症诊疗中的应用

5.1 疾病的早期筛查

在癌症早期，通过液体活检去检测特定基因的常见突变位点，可以对癌症进行早期筛查［67］。Beaver等［68］用dPCR检测了30名乳腺癌患者术前的血液样本，同时做了肿瘤组织分析，结果显示血液样本和肿瘤组织中的PIK3CA突变率有很高的一致性。说明检测血浆中ctDNA基因热点突变位点可以作为肿瘤组织检测的补充。在早期筛查中发现的原发性肿瘤患者，仅通过手术治愈癌症的可能性很高［69］。因此，这种早期筛查是未来降低癌症发病率和死亡率的最有希望的方法之一。但是，血液中ctDNA浓度在癌症早期普遍较低，所以通过该手段进行癌症早筛仍具有一定挑战性。

5.2 靶向药物的用药指导

在进展期NSCLC液体活检声明中［70］，ctDNA已被明确推荐用于指导NSCLC患者靶向药物选择。欧洲药品管理局（EMA）和FDA已批准使用罗氏诊断的EGFR 突变检测试剂盒作为伴随诊断［71］，以帮助从无法进行肿瘤活检的患者中选择EGFR突变阳性的NSCLC患者进行吉非替尼、厄洛替尼和奥西替尼治疗。FDA已批准Guardant Health基于NGS的液体活检测定法用于识别EGFR基因突变的NSCLC患者进行奥西替尼的治疗［71］。这些测试的临床实用性展示了ctDNA作为生物标志物的潜力。表2列举了一些已经批准用于ctDNA液体活检相关标志物检测试剂盒或检测试剂。

Table 2 ctDNA related marker detection kit or detection reagent表2 循环肿瘤DNA相关标志物检测试剂盒或检测试剂

5.3 治疗效果的实时监控

Dawson等［74］评估了利用ctDNA来监测转移性乳腺癌治疗效果。将30名接受全身治疗的转移性乳腺癌患者的ctDNA、循环肿瘤细胞和癌症抗原（CA15-3）的测定进行了比较。用WGS来鉴定体细胞基因组改变，并设计了特殊的方法来量化连续收集的血浆样品中ctDNA。与此同时测量癌症抗原水平和循环肿瘤细胞的数量。结果发现，在体细胞基因组改变的女性中，分别以97%、78%、87%的比例检测到ctDNA、循环肿瘤细胞和癌症抗原。ctDNA水平显示出更广泛的动态范围，并且与肿瘤负荷变化的相关性更大。表明ctDNA能够为转移性乳腺癌患者提供丰富的信息，是具有高特异性和高灵敏性的生物标志物。

5.4 微小残留病灶以及复发风险的预后评估

微小残留病灶用于描述治疗后体内存在少量肿瘤细胞［75］。在患者实施切除肿瘤手术后，一般会有较高的复发风险，因此，更好地评估微小残留病灶是癌症管理的关键。ctDNA分析可以作为复发监测工具。在术后的不同时间点采集一系列的血浆样本，检测已知存在的原发性肿瘤细胞突变，数据显示ctDNA的检出与转移性复发风险的增加密切相关［76］。在该领域早期的一项研究报道［77］，对20名长期随访的原发性乳腺癌的患者进行ctDNA动态监测，通过微滴式dPCR对血浆中ctDNA肿瘤特异性染色体重排进行检测，首次发现ctDNA监测能准确区分病人是否出现临床检测到的术后复发。基于ctDNA的检测，在86%的患者中提前11个月预测到复发风险。另外，基于NGS的ctDNA检测也可以评估患者的微小残留病灶水平，在预测疾病复发风险方面具有较高的敏感性和特异性［78］。能够使医生动态监测和确认疾病的缓解，发现复发的早期迹象，并尽早开始治疗以有效管理癌症。该领域正在进行大量研究，尽管许多研究已经表明ctDNA检测微小残留病灶的临床效用［79］，但仍然有许多局限性问题待研究者解决。

5.5 疾病进展检测

血浆中ctDNA浓度的增加与疾病进展之间存在相关性。Janssen等［80］成功开发了一个非线性混合效应模型，描述了接受厄洛替尼或吉非替尼治疗的NSCLC患者血浆中L858R、19Del和T790M浓度的动力学。此外，通过使用参数时间事件模型，L858R和19Del浓度的相对变化被确定为该患者群体疾病进展的重要预测因素。先前已经表明，在患者血浆中测量的ctDNA浓度趋势与患者肿瘤组织中检测到的突变以及通过CT扫描测量的肿瘤体积变化相关。在这项研究中，与可检测到ctDNA浓度的患者相比，ctDNA浓度低于检出限的患者表现出更长的无进展生存期和总生存期。与标准CT扫描诊断相比，ctDNA的检测可以更早地发现非小细胞肺癌复发。

6 总结与展望

ctDNA检测具有微创、可实时取样、反映的信息全面等特点，可以应用于癌症的早期筛查、靶向药物选择、疗效实时监控，以及复发风险的预后评估等方面。此外，ctDNA检测可与其他多组生物标志物协同使用，如早期检测抗原、表观遗传标记物、循环肿瘤RNA、外泌体相关免疫标记物等，以增强早期检测。尽管ctDNA释放到血液中的确切途径尚不完全清楚，但其存在以及数量与肿瘤负荷或转移有关，对癌症患者的诊断及治疗有重要价值。

随着NGS和dPCR等技术的不断发展，越来越多基于此类技术开发的液体活检方法已经可用于临床环境，但仍存在实验室间检测结果重复性和再现性较差的难题［81-82］。因此，ctDNA的临床检测全过程，包括可靠的血浆和血清收集和存储方法、DNA分离和富集技术、可信可比的检测方法和数据分析等，需要建立统一的标准及规范，从而进一步提高ctDNA的临床应用价值。