肉苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠降血糖作用

程世赞,廉婧,聂紫璇,苏国明,常源,史辑,2,贾天柱,2

(1.辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600;2.辽宁省中药炮制技术产业创新中心,辽宁 大连 116600)

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎。春季苗刚出土时或秋季冻土之前采挖,除去茎尖,切段,晒干[1]。肉苁蓉具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效,临床上多用于肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等。肉苁蓉的药理作用包括抗衰老、抗氧化、抗痴呆、抗疲劳以及润肠通便等[2-3]。肉苁蓉主要成分有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、多糖等,其中苯乙醇苷类、多糖类成分为主要药效物质[4]。现代的药理研究表明,肉苁蓉多糖具有调节免疫活性、抗衰老、改善学习记忆能力、保护神经、抗肝损伤、抗病毒、抗肿瘤、影响肠道菌群等诸多药理作用[5]。肉苁蓉总苷具有滋补肝肾、益精血、抗氧化、抗衰老、免疫增强和神经保护作用[6]。《中国药典》2020年版(一部)收载有肉苁蓉片和酒苁蓉两个炮制品种,课题组前期研究发现,生品肉苁蓉偏于润肠通便,酒苁蓉补肾助阳作用明显增强。肉苁蓉总苷和总多糖为补肾阳的有效部位,肉苁蓉寡糖类成分为其润肠通便的有效部位[7]。肉苁蓉酒蒸过程中,苯乙醇苷类成分发生较大的变化,毛蕊花糖苷含量下降,而其同分异构体异毛蕊花糖苷含量明显增加[8]。

2型糖尿病是由胰岛素抵抗,伴随胰岛β细胞结构和功能性损伤,继而导致胰岛素分泌不足,以血糖升高为主要特征的代谢疾病[9]。中医认为糖尿病往往与肾精有关,肾藏精,精亏则可诱发糖尿病,甚至会导致糖尿病肾病。2型糖尿病症状多表现为尿多、乏力、口渴喜饮、多食易饥等与肾阳虚类似症状,故中医临床治疗糖尿病多以补肾固本、补益肾阳为主[10-11]。文献报道,肉苁蓉中的苯乙醇苷类成分,如松果菊苷和毛蕊花糖苷不仅能够抑制餐后血糖水平的增加,而且能提高淀粉负荷小鼠的葡萄糖耐量[12-15]。这也提示着肉苁蓉具有降血糖的作用。

db/db小黑鼠是由于瘦素(leptin)受体基因缺陷导致的先天肥胖性T2DM小鼠,其瘦素受体基因失去功能,在出生后2周内就发生高胰岛素血症,3～4周发展为肥胖,8周后就发展为非常严重的高血糖症,期间伴有胰岛素抵抗,β细胞功能衰竭[16-17],一般在8～10个月内死亡,可并发明显的肾脏疾病[18]。本研究以db/db小黑鼠为实验对象,分别富集肉苁蓉和酒苁蓉的总多糖、总寡糖和总苷类成分,并对不同提取部位的降血糖作用进行了比较研究,期望为肉苁蓉酒蒸的炮制机理提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物自发性2型糖尿病小鼠模型的BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/JNju(基因型:db/db糖尿病小黑鼠)雄性7周龄的小黑鼠,体重35～40 g,db/db m+(基因型:db/m+ 小黑鼠)雄性7周小黑鼠,体重量18～20 g,由南京大学-南京生物医药研究院,南京大学模式动物研究所提供。本研究方案通过辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核,批准编号:2018YSDW-030-02。

1.2 药物与试剂肉苁蓉药材于2019年5月采自内蒙古阿拉善(批号:20190508-1),经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为列当科植物肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma) 的干燥带鳞叶肉质茎,标本保存于辽宁省中药炮制技术产业创新中心。

松果菊苷(echinacoside)对照品(批号:MUST-13080801,纯度≥98%)、毛蕊花糖苷(verbascoside)对照品(批号:MUST-13122711,纯度≥98%)、异毛蕊花糖苷(isoacteoside)对照品(批号:MUST-15081001,纯度≥99.77%)、甜菜碱对照品(批号:894-200001,纯度≥98%)均购自中国药品生物制品检定所;D101型大孔树脂由成都曼斯特生物科技有限公司提供。

小鼠抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)单克隆抗体[批号:ab62623,艾博抗(上海)贸易有限公司];PAS(批号:G1281,北京索莱宝科技有限公司);抗荧光淬灭封片液(海碧云天生物技术有限公司);SP9001 兔SP检测试剂盒(无锡傲锐东源生物科技有限公司);DAB、胰岛素(INS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)、小鼠总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、尿微量白蛋白(mALB)试剂盒(上海朗顿生物技术有限公司)。胆固醇、二甲苯、无水乙醇、乙腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器ACQUITY H-Class UPLC(美国Waters公司);血糖仪和血糖试纸条(拜耳医药保健有限公司);AE240型1/10万电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FA1004型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);BN-518生物组织自动包埋机(湖北伯纳医疗科技有限公司);电热恒温干燥箱(忠伟电子仪表有限公司); Leica RM2245切片机(德国Leica Biosystems公司);pH酸度计(上海鹏顺科学仪器有限公司);Milli-Q Integral 3 型净水机 (法国Molsheim公司)。

2 实验方法

2.1 肉苁蓉炮制品制备肉苁蓉:取肉苁蓉药材,洗净杂质,上锅常压蒸制2 h,切成6 mm,70 ℃烘干。

酒苁蓉:取肉苁蓉饮片,加入适量黄酒拌匀,闷润8 h(黄酒∶水=1∶1),高压蒸制4 h,70 ℃烘干。(每100 g肉苁蓉用黄酒30 mL)。

2.2 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位富集取肉苁蓉/酒苁蓉粗粉30 g,加10倍量水加热回流提取2次,每次2 h,合并提取液,浓缩,加乙醇至含醇量达60%,低温沉淀12 h,抽滤,沉淀即为粗多糖部位。将上清液浓缩至适当浓度,上D101大孔吸附树脂,依次用水和不同浓度的乙醇洗脱,收集水洗脱液,减压浓缩至稠膏,即为总寡糖部位;40%乙醇洗脱液,减压浓缩干燥,即为肉苁蓉总苷部位。

2.3 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位含量测定

2.3.1 肉苁蓉/酒苁蓉总多糖的含量测定称取葡萄糖样品20.00 mg于50 mL容量瓶中,制成0.4 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液,分别吸取 3、4、5、6、7 mL置于50 mL容量瓶,用水定容至刻度,分别吸取各个浓度梯度的葡萄糖溶液2.0 mL于试管中,另取等量蒸馏水作空白对照,在各管加入1 mL 5%苯酚,摇匀,迅速加入5 mL浓硫酸,放置10 min,置40 ℃水浴中保持15 min,取出,迅速冷却至室温,在490 nm处测其吸光度值,以吸光度(A)为纵坐标,葡萄糖浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y=8.37X-0.162 8(R2=0.994 6)。

精密称取生、制品总多糖部分的粉末1.0 g,分别置于50 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,精密吸取2.0 mL于试管中,同标准曲线制备方法,测定,即得。

2.3.2 肉苁蓉/酒苁蓉中甜菜碱的含量测定

2.3.2.1 对照品溶液制备精密称定甜菜碱对照品1.17 mg,放入5 mL量瓶中,加入50%甲醇溶解并定容,即得。

2.3.2.2 色谱条件色谱柱为Ecosil 120-5-AMINO色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-水(99.5∶0.5),柱温:30 ℃,检测波长:194 nm,流速:0.6 mL·min-1,进样量10 μL,色谱图见图1。

A.甜菜碱对照品;B.肉苁蓉总寡糖部位;C.酒苁蓉总寡糖部位

2.3.2.3 供试品溶液的制备精密称取生、制品总寡糖部位的粉末1.0 g,分别置于5 mL容量瓶中,加蒸馏水溶解并定容至刻度,摇匀,过0.45 μL微孔滤膜,即得。

2.3.2.4 样品含量测定精密吸取生、制肉苁蓉中总寡糖供试品溶液,按“2.3.2.2”项下条件测定,计算样品中甜菜碱含量。

2.3.3 肉苁蓉/酒苁蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷含量测定

2.3.3.1 对照品溶液的制备精密称定松果菊苷4.50 mg、毛蕊花糖苷 4.80 mg、异类叶升麻苷5.05 mg分别放入5 mL容量瓶内,加50%甲醇溶解并定容至刻度,分别取各对照品溶液200 μL,置于进样小瓶内,加400 μL 50 %甲醇,混匀,制成混合对照品溶液,摇匀,即得。

2.3.3.2 色谱条件色谱柱为Ecosil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),甲醇为流动相A,0.1%甲酸为流动相B,梯度洗脱,0～45 min,30% A→70% A,流速1.0 mL·min-1,柱温30 ℃,检测波长330 nm,进样量10 μL,色谱图见图2。

A.混合对照品;B.肉苁蓉总苷部位;C.酒苁蓉总苷部位 1.松果菊苷;2.毛蕊花糖苷;3.异类叶升麻苷

2.3.3.3 供试品溶液的制备精密称取生、制品总苷部分粉末1.0 g,分别置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。各精密吸取 5 mL置于10 mL容量瓶中,加入50%甲醇定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.3.3.4 样品含量测定精密吸取肉苁蓉总苷样品,按“2.3.3.2”项下条件测定。计算样品中松果菊苷、毛蕊花糖苷以及异类叶升麻苷的含量。

2.4 动物分组、造模及给药动物房为12 h光照、12 h黑暗,相对湿度为50%～70%,室温为18～22 ℃。db/db小黑鼠和db/m小黑鼠(正常对照组)以普通饲料正常喂养,至9周龄开始实验,除去正常对照组外,其余db/db小黑鼠根据血糖值及体重随机分为8组,分别是模型组、阳性对照组、肉苁蓉总多糖组、肉苁蓉总寡糖组、肉苁蓉总苷组、酒苁蓉总多糖组、酒苁蓉总寡糖组、酒苁蓉总苷组。除正常对照组和模型组外,其余各组大鼠按2 mL/100 g的剂量连续4周灌胃给药,药液浓度均为4.1 g·kg-1,正常对照组和模型组同法同量灌胃生理盐水。

2.5 肉苁蓉不同炮制品提取部位对db/db小黑鼠血糖水平的影响

2.5.1 口服葡萄糖耐量(OGTT)检测给药26 d 后,禁食12 h,次日给药60 min 后,各组小黑鼠分别给予2.0 g·kg-1的葡萄糖,分别于0、0.5、1.0、2.0 h尾静脉取血测定血糖值,以血糖值为纵坐标,时间为横坐标,制作血糖变化图,并按公式计算各实验组血糖曲线的线下面积(AUC,hmmoL·L-1)[19]。

AUC=A×0.25+B×0.50+C×0.75+D

式中:A、B、C、D分别为0、0.5、1.0、2.0 h 的血糖值。

2.5.2 胰岛素抵抗指数及动脉硬化指数计算根据文献方法计算胰岛素抵抗指数[20]:HOMA-IR=Glucose×Insulin/22.5,HOMA-β=20×Insulin/(Glucose-3.5)×100%。IR是胰岛素抵抗,β(%)是β细胞功能。葡萄糖的摩尔单位mmoL·L-1。胰岛素以mU·L-1给出。葡萄糖和胰岛素数字都是在禁食期间检测。根据Zheng等[21]描述的方法计算动脉硬化指数(Atherogenic index),计算方法:Atherogenic index=(TC-HDL-C)/HDL-C。

2.5.3 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠血清INS、HbA1c的影响取冻存血清样品放至室温后,用于INS、HbA1c酶联免疫试剂盒的测试, 严格按照试剂盒说明书的方法及步骤进行操作。

2.6 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肝脏氧化应激水平影响取冻存血清样品放至室温后,用于MDA、SOD酶联免疫试剂盒的测试, 严格按照试剂盒说明书的方法及步骤进行操作。

2.7 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肝脏脂肪代谢的影响大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平测定均采用相关试剂盒测定,具体测定步骤参考试剂盒说明书。

2.8 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠血浆和尿液中UA、Cr以及mALB的影响取冻存血浆、尿液样品放至室温后,用于UA、Cr、mALB酶联免疫试剂盒的测试,严格按照试剂盒说明书的方法及步骤进行操作。

2.9 HE染色法观察胰腺和肾脏病理切片取出经10%多聚甲醛固定液浸泡24 h后的胰腺、肾脏组织,蒸馏水清洗组织后保存于70%乙醇中。取出组织样品,经过梯度乙醇脱水、透明处理、石蜡包埋和切片处理,然后用苏木精和伊红染色(H&E染色)。待切片胶干后用高分辨率数码成像系统观察切片并拍照。

2.10 免疫组化法测定肾脏组织type-IV collagen的表达取肾脏切片脱蜡至水后进行抗原修复,10%山羊血清封闭,一抗4 ℃孵育过夜,洗涤后孵育二抗,现配溶液DAB显色,洗涤、脱水、封片,于光学显微镜下观察肾脏组织type-IV collagen蛋白表达。

2.11 统计学方法运用GraphPad Prism Version 5.01(2007,GraphPad Software inc)软件分析数据,结果以mean±S.E.M.表示,两组间差异进行One-way ANOVA(followed by Bonferroni′s compare selected pairs of column test)方法,P<0.05为差异显著,具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位含量测定结果按“2.3”项下条件测定,肉苁蓉及酒苁蓉不同提取部位含量测定结果见表1。

表1 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位含量测定结果

3.2 药理学指标测定结果

3.2.1 一般情况观察动物实验周期为4周,每周测定小黑鼠的空腹体重,结果见表2。灌胃实验开始至结束,模型组小黑鼠的体重出现持续上升,符合2型糖尿病模型体重增加的特征。正常对照组大鼠的体重基本不变。不同给药组对db/db小黑鼠灌胃1周后,与模型组相比,各给药组大鼠体重增加的状态均有不同程度改善,其中以酒苁蓉总苷的改善作用最为明显(P<0.05);不同给药组对db/db小黑鼠灌胃2周和4周后,酒苁蓉寡糖体重改善明显(P<0.05或P<0.01)。以上结果表明,肉苁蓉及酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠有降低体重的作用,结果见表2。

表2 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠体重的影响(g)

3.2.2 肉苁蓉不同炮制品提取部位对db/db小黑鼠血糖水平的影响正常对照组db/db小黑鼠血糖均维持在一个正常水平(4.3～5.7 mmoL·L-1),而模型组小黑鼠血糖持续升高(P<0.01)。与模型组相比,给药1周后,肉苁蓉总多糖、总寡糖、总苷组及酒苁蓉总多糖、总寡糖、总苷FBG降低(P<0.01);给药2周后,酒苁蓉总苷FBG降低(P<0.05);给药3周后,肉苁蓉总多糖和酒苁蓉总寡糖FBG降低(P<0.05或P<0.01);给药4周后,肉苁蓉总多糖、总寡糖及酒苁蓉总多糖、总寡糖、总苷FBG降低(P<0.05),结果见表3。

表3 肉苁蓉不同炮制品及提取部位对db/db小黑鼠FBG值的影响(mmoL·L-1)

在口服葡萄糖耐量实验(见表4)中,正常对照组小黑鼠的平均血糖水平在30 min时达到峰值,然后快速下降到正常水平。而模型组小黑鼠的平均血糖水平在30 min达到峰值后,继续保持在较高的水平。与模型组相比,各给药组小黑鼠血糖达到最高值后呈不同程度的下降趋势,其中酒苁蓉总多糖、总寡糖和总苷组下降速度较快。此外,根据计算得各组AUC,结果显示各给药组小黑鼠AUC均低于模型组,肉苁蓉总多糖和酒苁蓉总苷降低了给予葡萄糖后2个时间点(90、120 min)的血糖值(P<0.05或P<0.01),肉苁蓉总寡糖和酒苁蓉总多糖降低了给予葡萄糖120 min后的血糖值(P<0.05),酒苁蓉总寡糖降低了给予葡萄糖后3个时间点(0、90、120 min)及曲线下面积(P<0.05或P<0.01)。结果表明,肉苁蓉和酒苁蓉可改善db/db小黑鼠的OGTT能力。

表4 肉苁蓉不同炮制品及提取部位对db/db小黑鼠OGTT的影响

与正常对照组相比,模型组小黑鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、HbA1c水平升高(P<0.05),胰岛β细胞分泌指数(HOMA-β)水平降低。与模型组相比,肉苁蓉寡糖组、肉苁蓉多糖组、酒苁蓉寡糖组与酒苁蓉总苷组血清HbA1c含量明显降低(P<0.05);肉苁蓉多糖组、酒苁蓉多糖组、酒苁蓉寡糖组与酒苁蓉总苷组HOMA-IR指数明显降低(P<0.05);经过给药组干预4周后,与模型组相比,各给药组小黑鼠胰岛β细胞分泌指数水平均有不同程度的升高,结果见表5。

表5 db/db小黑鼠的HOMA-IR、HOMA-β和血清HbA1c、INS水平

胰岛素属于一种蛋白质激素,主要由胰腺组织中的胰岛β细胞合成与分泌,参与机体的糖代谢,维持机体血糖平衡,血清INS水平可反映糖尿病治疗的效果。从表5可知,与正常组相比,模型组小黑鼠的INS水平显著降低(P<0.01)。经过给药组干预4周后,与模型组相比,各给药组小黑鼠空腹血清胰岛素水平均有不同程度的升高,其中以肉苁蓉和酒苁蓉的总苷组升高最为明显。结果表明,各给药组可提高db/db小黑鼠的血清胰岛素水平,促进胰岛β-细胞分泌胰岛素。

3.2.3 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肝脏氧化应激水平影响模型组小黑鼠肝脏MDA水平显著高于正常组(P<0.05)。经过给药组干预4周后,与模型组相比,各给药组的MDA水平均出现不同程度下降(P<0.05),其中肉苁蓉总多糖、肉苁蓉总寡糖、肉苁蓉总苷、酒苁蓉总苷和酒苁蓉总寡糖的小黑鼠肝脏组织MDA水平减少最明显(P<0.05或P<0.01)。结果表明,肉苁蓉对降低db/db小黑鼠肝脏组织MDA水平具有一定的效果,改善效果好于酒苁蓉给药组。

模型组小黑鼠肝组织中SOD活力低于正常对照组(P<0.05)。当给予肉苁蓉和酒苁蓉不同提取部位灌胃后,可提高db/db小黑鼠肝脏组织中SOD活力,与模型组相比,各给药组均可恢复SOD活力,其中肉苁蓉总苷组差异有统计学意义(P<0.05),结果见表6。

表6 db/db小黑鼠的肝脏重量、相对肝脏重量和肝脏SOD、MDA水平

3.2.4 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肝脏脂肪代谢的影响为评价肉苁蓉/酒苁蓉对db/db小黑鼠的血清血脂代谢水平影响,实验检测了糖尿病脂质代谢相关标志物。从表7可知,与正常对照组相比,模型组小黑鼠血清LDL-C水平显著升高(P<0.05),HDL-C水平降低。经过给药干预4周后,与模型组相比,肉苁蓉总多糖、总寡糖和总苷组以及酒苁蓉总多糖、总寡糖和总苷组的血清TG、TC和LDL-C水平均出现不同程度降低,HDL-C水平升高,其中肉苁蓉总苷组有改善TC水平作用(P<0.05)。结果表明,肉苁蓉和酒苁蓉在一定程度上可改善db/db小黑鼠的脂代谢紊乱。

表7 db/db小黑鼠的肝脏TC、LDL-C、HDL-C和TG水平

表8 治疗第28天db/db小黑鼠血浆和尿液中UA、Cr以及mALB水平

3.2.5 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠血浆和尿液中UA、Cr以及mALB的影响给药4周后,与模型组相比,肉苁蓉总多糖、总寡糖以及酒苁蓉总苷组的UA、Cr以及mALB水平均出现不同程度的降低,其中肉苁蓉总苷组对血浆中的Cr以及尿液中的Cr、UA和mALB有降低作用(P<0.05或P<0.01),酒苁蓉多糖组对尿液中的UA、Cr以及mALB水平改善作用(P<0.05或P<0.01),酒苁蓉对血浆中UA水平有改善作用(P<0.05),肉苁蓉总苷一定程度上可降低db/db小黑鼠血浆UA、Cr以及mALB水平。

3.2.6 肉苁蓉不同炮制品及提取部位对db/db小黑鼠胰腺、肾脏组织病理学影响正常对照组小黑鼠胰腺组织无病理学损伤,胰岛可见清晰边缘,胰岛细胞呈椭圆形且有序排列在胞浆中,细胞核呈圆形,胰岛数量较多且体积较大。模型组小黑鼠胰腺组织无完整胰岛,胰岛边缘不清晰且形状不完整,胰岛 β 细胞排列杂乱无章,数量较少,并出现萎缩现象,胰腺出现严重损伤。与模型组大鼠相比,经过肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位灌胃4周后,各提取部位给药组的胰岛组织部分恢复,胰岛细胞体积出现不同程度变大,胰岛细胞可见清晰的边界,排列无序的状况得到改善。其中,以肉苁蓉和酒苁蓉总苷组恢复的最好。

图3 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠胰腺病理学的影响(H&E,200 ×)

图4 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肾脏病理学的影响(H&E,200 ×)

图5 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肾脏type-IV collagen表达型胶原的表达结果

正常对照组小黑鼠的肾脏组织无明显损伤,肾小球结构、形态以及与肾小球囊腔的比例正常,近端小管与远端小管的管壁薄厚、管腔大小正常。模型组小黑鼠肾小球结构、形态、大小不规则,血管球萎缩、肾球囊腔消失,近端小管与远端小管的管壁薄厚不匀、管腔大小不一、界限不清模糊,肿胀坏死,有大量的炎性细胞浸润。与模型组大鼠相比,经过肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位灌胃4 周后,各提取部位给药组的肾脏组织有所改善,肾小球结构、形态、大小接近正常,近端小管与远端小管的管壁薄、管腔大小得到改善,肿胀减轻,有的部位仍可见少量的炎性细胞浸润。其中以肉苁蓉多糖组和酒苁蓉多糖组恢复最好。

3.2.7 肉苁蓉/酒苁蓉不同提取部位对db/db小黑鼠肾脏组织中type-IV collagen表达与正常组相比,模型组小黑鼠肾脏type-IV collagen蛋白表达发生了明显变化(P<0.05)。与模型组相比,各给药组小黑鼠的平均肾膜基质面积增加,其中肉苁蓉多糖组、酒苁蓉寡糖组、酒苁蓉总苷组中type-IV collagen的表达改善,而肾基膜中的type-IV collagen表达差异无统计学意义。

4 讨论与结论

本文研究表明肉苁蓉多糖部位经过酒蒸后含量下降,推测多糖在酒蒸过程中发生水解;肉苁蓉寡糖部位中的甜菜碱经过酒蒸后含量增加,炮制过程中可能生成了甜菜碱类成分,而使甜菜碱含量增加;总苷类成分,松果菊苷的含量稍有下降,毛蕊花糖苷含量下降,异类叶升麻苷含量上升。

2型糖尿病(T2DM)的病因众多,其病机是由于β细胞功能障碍和胰岛素抵抗而引起糖、脂肪、蛋白质的代谢紊乱。其中基因、肥胖和体力活动显然是2型糖尿病最重要的风险因素[22]。从中医学角度分析,2型糖尿病属于“消渴”范畴,而脾肾阳虚证是因为阳气耗损,在脾阳虚的状态下无法发挥滋补脾肾的作用,从而导致阳气损伤的发生[23]。HbA1c是评价糖尿病血糖控制的“金标准”。英国前瞻性糖尿病研究发现HbA1c水平越高,糖尿病慢性并发症发生风险越大。本实验表明,肉苁蓉多糖和寡糖及酒苁蓉寡糖和总苷显著降低HbA1c水平。

INS分泌相对不足是2型糖尿病的发病机制之一[24]。本研究证明,肉苁蓉及酒苁蓉各部位均能提高胰岛素水平,说明生制肉苁蓉不同提取部位可增加胰岛素分泌。mALB对于早期肾损害具有重要参考意义,而尿Cr能准确反映肾功能状态[25]。肉苁蓉总苷和酒苁蓉总多糖显著降低了mALB水平,肉苁蓉总苷、酒苁蓉多糖和寡糖显著降低了Cr水平,降低了肾功能损害。UA通过参与氧化应激,导致内皮功能障碍,加重胰岛素抵抗[26]。肉苁蓉总苷和酒苁蓉总多糖显著降低UA水平,使尿酸分泌减少,降低胰岛素抵抗。

2型糖尿病血脂异常的主要表现为HDL-C、LDL-C、TG水平升高等,这些因素同样是诱发动脉粥样硬化的因素[27]。本实验中,肉苁蓉总多糖、总寡糖和总苷组以及酒苁蓉总多糖和总苷组的血清HDL-C、LDL-C以及TG水平均出现不同程度降低,一定程度上可降低血脂从而促进降血糖作用。肉苁蓉不同提取部位可显著提高HDL-C/TC水平,降低动脉粥样硬化指数。提示肉苁蓉不同提取部位对糖尿病和心血管疾病的治疗均有益处。

研究发现,MDA在糖尿病患者体内的表达水平比正常人高;超氧化物歧化酶SOD在糖尿病患者的活性比正常人低,提示氧化应激可能在糖尿病肾病的发生发展中起重要作用[28]。本实验各给药组的MDA水平均出现不同程度下降,SOD活力均有提高,提示在肉苁蓉及酒苁蓉各提取部位有抑制氧化应激的作用。

本文深入研究了肉苁蓉不同提取部位的降血糖作用,发现肉苁蓉和酒苁蓉总苷具有较好的降血糖作用,酒苁蓉多糖和寡糖也有一定的降血糖作用,为临床合理应用肉苁蓉及其炮制品提供可靠实验依据。肉苁蓉是我国著名的补益中药,其药理作用广泛,在临床疾病的预防和治疗中发挥巨大的作用,其有很好的应用前景。然而,肉苁蓉具有抗高血糖和降血脂作用的生物活性成分和机制有待进一步研究。