中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定

陶 颖， 杨东亮， 王宝菊， 刘 艺， 桂文甲， 李 智， 樊和斌

1 中国人民解放军中部战区总医院感染科， 武汉 430030

2 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科， 武汉 430030

α/β 干扰素共用Ⅰ型受体，该受体有α、β 两个亚单位，分别称为IFNAR1 和IFNAR2［1-4］。中国旱獭是研究HBV 感染的重要动物模型［5-6］。本研究对中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β 亚基（marmata himalayana type Ⅰ interferon receptor β subunit，mhIFNAR2）进行了克隆、表达和抗体制备，并在体外用siRNA 鉴定其功能，为研究干扰素抗土拨鼠肝炎病毒的确切机制、土拨鼠肝炎病毒持续感染的原因及提高干扰素的疗效奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2 细胞、DH5α、BHK 细胞、脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）由同济医学院附属协和医院感染科实验室保存；WH12-6 细胞由德国埃森大学陆蒙吉教授提供；pSUPER 由美国Baylor 大学细胞生物学系冯新华教授惠赠；引物和RNAi 由上海英俊公司合成；限制性内切酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ、pMD18T 载体、DL2000、T4 DNA 连接酶、T4 多核苷酸激酶购自Takara 公司；Trizol、Lipofectamine2000TM购自Invitrogen 公司；质粒抽提试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限公司生产；Taq 酶和胶回收试剂盒为Tiangen公司产品；dNTP由上海凌飞公司提供；DMEM 由HyClone公司提供；M-MLV 逆转录酶、RNasin 由美国Promega 公司提供；小牛血清购自杭州四季青公司；凝胶成像分析系统购自美国UVP 公司。根据其他哺乳动物干扰素受体的保守性设计引物，由上海英俊公司合成，其他哺乳动物在GenBank 中的序列号分别为：鼠NM_010509，牛NM_174553，羊NM_001009342，人NM_207585（表1）。RT-PCR扩增目的基因mhIFNAR2（50-181aa）。

表1 干扰素受体β亚基的引物序列Table 1 Primer sequences for interferon receptor β subunit

1.2 方法

1.2.1 mhIFNAR2 的克隆 根据其他哺乳动物干扰素受体的保守序列设计引物，克隆具体步骤见文献［7］。

1.2.2 Ⅰ型干扰素受体β 亚基的表达及多克隆抗体的制备 测定重组质粒pRSET-B.mhIFNAR2核酸序列；重组质粒pRSET-B. mhIFNAR2 转化高效表达菌Rossetta（DE3）plysS；菌体总蛋白的Western Blot 分析：转膜后利用兔抗His-probe（H-15）作为一抗，HRP 标记的羊抗兔IgG 作为二抗进行Western Blot 检测目的蛋白的表达；融合蛋白的大量制备及纯化：取纯化蛋白液20 μL，加2×蛋白电泳上样缓冲液20 μL 于管中，100 ℃煮沸5 min。SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化效果；检测蛋白纯度：将目的蛋白表达过程中的各个组分进行SDSPAGE 电泳，结果进行蛋白条带灰度扫描，并用Gelwork 1D advanced V4.01软件分析。检测蛋白浓度：通常每次纯化的样本都要行SDS-PAGE 检测纯化样本的纯度，高纯度的样本被收集起来，用标准的Bradford法（考马斯亮蓝G-250 法）测定蛋白浓度，为下一步免疫动物作准备。以纯化的重组蛋白mhIFNAR2B（50-181aa）为免疫原，每次取120 μg溶于1 mL PBS中，再与等体积的氢氧化铝佐剂混合，按40 μg/只的抗原剂量，分别免疫3 只BALB/c 小鼠，颈背部皮下多点注射。第14 天和第28 天时各加强免疫一次，加强免疫的方法和抗原剂量同上。第35天摘小鼠眼球取血，静置离心后分离血清。

1.2.3 多克隆抗体特异性鉴定 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）来源于中国旱獭，其分离的步骤如下：1 mL抗凝全血加入等体积的PBS混匀；将步骤1中的稀释全血用滴管沿管壁缓慢叠加在另一个装有2 mL的淋巴细胞分离液离心管内，注意保持清楚界面；2 500 r/min，离心20 min，管内液体分三层（从下至上为红色细胞层、分离液层、血浆层）。上层与中间层有一白色云雾状狭窄带，包括淋巴细胞、单核细胞、血小板；抽吸云雾层至灭菌管中，加入5 倍体积以上的灭菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，离心5 min，弃上清；加入5倍体积以上的灭菌PBS（或D-Hank’s），2 000 r/min，离心5 min，弃上清；加入含10%小牛血清的RPMI1640 500 μL 重悬细胞，每张APES处理的玻片上滴加100 μL，自然风干后用冰丙酮固定30 min 行免疫组化及免疫荧光检测。用Western Blot检测其滴度。

1.2.4 mhIFNAR2功能的初步鉴定

1.2.4.1 中国旱獭α 干扰素的制备 将生长状态良好的BHK 细胞接种到6 孔板内；生长24 h 后，细胞长满至80%～90%；溶液A：2.5 μg 质粒+Optim 无血清培养基，总体积为100 μL；溶液B：5 μL Lipofectamine2000+95 μL Optim 无血清培养基；两者室温放置5 min；混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置25 min；期间用无菌D-hank’s及培养基洗细胞两次，并加入1 600 μL 无血清培养基；溶液A+溶液B内加入200 μL Optim 无血清培养基，轻柔混匀后加入培养细胞孔内；37 ℃孵育5 h；换用完全培养基2.0 mL 培养48 h 后收获培养上清液，分装后冻存于-70 ℃，待测干扰素生物学活性。

1.2.4.2 EMCV感染滴度的测定 将生长在培养瓶内的WH12-6细胞消化后加入Ham’s-12培养基，轻轻吹打分散细胞后转种到96 孔板内，100 μL/孔；待细胞在96 孔板内长成单层后倾去培养液，滴定不同浓度的EMCV 到细胞孔内，从原液逐渐至10-10，呈10 倍系列稀释，100 μL/孔，同时做细胞阴性对照，每个梯度接种4 孔细胞，第2 天观察细胞生长状况，计数不同稀释度出现细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）孔数，然后按Reed-Muench 法计算半数组织培养感染剂量（TCID50）。

1.2.4.3 中国旱獭干扰素α效价的确定 将生长在培养瓶中的WH12-6 细胞消化后加入Ham’s-12 培养基，轻轻吹打分散细胞转种到96孔细胞培养板内；待细胞在96孔板内长成单层后倾去培养液，加入不同4 倍系列稀释的BHK 细胞转染上清100 μL/孔，每个稀释度有4 个细胞孔，继续培养24 h，加入0.1 mL EMCV，继续培养24 h，以保护50%细胞不出现CPE 的BHK 细胞转染上清液最高稀释度作为干扰素效价。

1.2.4.4 siRNA 干扰实验 WH12-6 细胞培养于含10%FBS 的Ham’s-12 培养基中，于5% CO2、饱和湿度及37 ℃条件下培养。勿使细胞融合度＞90%以防止细胞老化。siRNA由广州锐博公司提供合成，序列见表2。另外设计一条阴性对照序列，Blast验证为任何物种的无关序列。

表2 mhIFNAR2 siRNA 模板序列Table 2 Template of mhIFNAR2 siRNA

将正常培养于6孔板的WH12-6细胞于转染前改用无抗生素Ham’s-12 培养基培养24 h。取2 μL Lipofectamine 2000加入250 μL Opti-MEM培养基，轻轻混匀。室温孵育5 min。取20 μmol/L 合成siRNA，加入250 μL Opti-MEM培养基，siRNA 的终浓度分10、20 及50 nmol/L 三个梯度，轻轻混匀，室温孵育5 min。随后将两者轻轻混合，室温孵育20 min。加入一孔细胞中，用无血清无抗生素Ham’s-12培养基定容至2 mL。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h。换为含血清、抗生素的全培养基，培养24 h后加用中国旱獭干扰素刺激（同前），24 h后加Trizol提取RNA。用Trizol提取培养的WH12-6细胞总RNA，逆转录成cDNA，使用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR扩增，反应条件为95 ℃、60 s预变性，95 ℃、15 s共40个循环，60 ℃、20 s延伸。mhIFNAR2、MxA 荧光定量RT-PCR 引物序列如下：mhIFNAR2（正义）ACAATCCACCGTGCCAACT，mhIFNAR2（反义）AACAGCATCGCTTTCCCTC；MxA（正义）CAGATTGTCTACTGCCAGGACCAGGT，MxA（反义）AGCCGCTCCTTCAGGAACTTC；β-actin （ 正 义 ）TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC，β-actin（反义）TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG；通过标准曲线获得直线回归方程，从而得到各个目的基因mRNA 的拷贝数，将其除以内参的拷贝数，然后乘以104作为该目的基因的相对值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mhIFNAR2的克隆、鉴定及同源性比较 RT-PCR从脾组织中扩增出149～1 300 bp 的mhIFNAR2 片段，并经测序证实［7］。同源重组构建重组质粒，经PCR、酶切和测序证实，命名为pRSET-B.mhIFNAR2。mhIFNAR2149-1300核苷酸序列与土拨鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分别为98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%（图1）。

图1 mhIFNAR2片段核苷酸组成物种同源性比较Figure 1 Species homology comparison of mhIFNAR2

2.2 重组蛋白的表达

2.2.2 重组蛋白的小量诱导表达 SDS-PAGE 电泳可见，pRSET-B.mhIFNAR2重组质粒经IPTG诱导后1～6 h在大肠杆菌中均有表达，且在诱导4 h 时获得量最大，而空菌及空载体转化菌诱导4 h 在27 kD 处仅有较弱条带（图2）。

图2 SDS-PAGE电泳分析His-mhIFNAR2蛋白的表达Figure 2 Expression of His-mhIFNAR2 analyzed by SDS-PAGE

2.2.3 目的蛋白的纯化 诱导后的菌体超速离心后，经SDS-PAGE 电泳发现目的蛋白大部分存在于沉淀中，且主要以包涵体的形式存在。经Ni-NTA 纯化得到的目的蛋白纯度为95%，浓度约为160 μg/mL（图3）。

图3 pRSET-B.mhIFNAR2蛋白纯化图Figure 3 Purification of pRSET-B.mhIFNAR2

2.2.4 目的蛋白的Western Blot 检测 抗His 与纯化的重组蛋白反应，可见有特异性条带（图4）。

图4 纯化的目的蛋白Western Blot检测Figure 4 Western Blot analysis of the activity and specificity of antisera

2.3 制备抗体的检测

2.3.1 免疫组化检测抗mhIFNAR2多克隆抗体特异性 抗原抗体结合部位可见明显的阳性着色（图5a），mhIFNAR2抗原的分布主要呈胞质型和胞膜型。而应用正常小鼠血清作为一抗则无阳性显色（图5b）。

图5 mhIFNAR2多克隆抗体的免疫组化结果（DAB，×400）Figure 5 Immunohistochemical of mhIFNAR2 polyclonal antibodies（DAB，×400）

2.3.2 免疫荧光结果 PBMC 中mhIFNAR2 免疫荧光检测主要分布于细胞质和细胞膜（图6），而阴性对照则无阳性显色。

图6 PBMC中mhIFNAR2免疫荧光检测Figure 6 Stained with mouse anti-mhIFNAR2 antibody by immunofluorescence in PBMC

2.3.3 Western Blot检测 用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，获得了高效价的特异性多克隆抗体。经用Western Blot检测的效价为1∶1 000。

2.4 干扰素效价的测定 以保护50%的细胞不出现CPE的BHK细胞转染上清稀释度作为干扰素的效价，表3为EMCV 感染滴度测定结果，本实验所测得的干扰素效价为1∶128。

表3 EMCV感染滴度测定结果Table 3 Result of EMCV infection titer determination

2.5 siRNA 干扰效应 起始于840 位点的siRNA840 对WH12-6细胞mhIFNAR2基因无明显的抑制作用（P＞0.05）（图7）。起始于277位点的siRNA277（20 nmol/L）对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A 基因有明显抑制作用，差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）（表4）。

图7 不同浓度的siRNA840对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用Figure 7 The inhibitory effect of siRNA840 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

表4 不同浓度的siRNA277对WH12-6细胞mhIFNAR2、M×A基因的抑制作用Table 4 The inhibitory effect of siRNA277 at different concentrations on mhIFNAR2 and M×A

3 讨论

干扰素受体由α、β 两个亚基组成，当其与干扰素结合后迅速引起TYK2、JAK1、STAT1、STAT2磷酸化，进而激活转录产生各种抗病毒蛋白。尽管干扰素发现已有50年的历史，但直到1990年才鉴定出干扰素受体由α、β两个亚基组成。其中β 亚基有长、短及可溶等三种形式［8-10］。随着干扰素与其受体相互作用、信号转导机制及生物应答研究的深入，干扰素受体在介导干扰素抗感染中的天然免疫、获得性免疫以及肿瘤中的作用逐渐引起人们的注意，干扰素受体缺失引起严重的病原体感染［11-12］。但是，干扰素在不同的细胞中会产生相反的生物学效应。比如在大多数细胞中干扰素表现为抑制增殖，促进凋亡，却可延长记忆性T 淋巴细胞的存活时间［13-14］。因此，阐明干扰素受体复合物的功能有助于解释这些现象的原因。在乙型肝炎动物模型中阐明干扰素抗病毒的作用机制及HBV的持续性感染具有重要的临床意义。

本研究利用哺乳动物干扰素受体序列的保守区设计引物，成功地从中国旱獭脾组织中克隆出mhIFNAR2149-1300。mhIFNAR2149-1300核苷酸序列与土拨鼠、人、牛、羊及小鼠的同源性分别为98.05%、72.89%、69.17%、69.76%及64.95%。该结果与笔者前期克隆的中国旱獭其他分子相似［15-18］。

干扰素是具有多种生物功能的细胞因子，其发挥效应的始动环节是与其受体结合，使胞内段发生磷酸化，激活转录从而产生各种抗病毒蛋白。本研究目的是在mhIFNAR2克隆的基础上，在体外用抗体阻断及siRNA干扰的方法进一步证实所克隆基因的正确性，了解mhIFNAR2在干扰素信号通路的作用，为在乙型肝炎动物模型中国旱獭体内实验奠定基础。

前期研究［14］结果显示IFNAR2 与干扰素结合的重要位点包括E78、W101、I104 以及D105，而既往的一些研究［19-20］也发现干扰素受体胞外段作为免疫原可以产生中和抗体。因此本文选择了mhIFNAR2（50-181aa）胞外段重组蛋白作为抗原制备抗体。

本实验以胞外段mhIFNAR2 重组蛋白免疫小鼠，制备了抗mhIFNAR2 的多克隆抗体。对所获得的抗血清进行了Western Blot 检测，证实制备的多克隆抗体特异性良好，具有免疫学活性，不仅可以识别作为免疫原的融合蛋白，还能有效识别PBMC 中的mhIFNAR2 蛋白。免疫组化及免疫荧光检测可见mhIFNAR2 抗原的分布主要呈胞浆型和胞膜型。并且免疫血清在较高稀释浓度下即可检测到mhIFNAR2 蛋白，且无明显的非特异性条带，证实了多克隆抗体的高效性和抗mhIFNAR2 的特异性，为进一步研究mhIFNAR2 及干扰素在乙型肝炎动物模型中的作用提供了实验基础。

本研究用该抗体进行干扰素受体封闭实验，结果显示无明显作用（具体数据未展示），原因可能有：（1）某些抗体虽然可以与其受体结合，但是不能阻断干扰素的作用，且不同干扰素型别存在差异［21-22］；（2）不同细胞系与抗体的结合力也存在差异［17］；（3）一些抗体并不能阻止干扰素与其受体结合［22］。此外，本研究制备的是多克隆抗体，一是没有纯化，二是某些多克隆位点可能对干扰素信号通路产生影响。

本研究设计、合成针对中国旱獭mhIFNAR2的siRNA，并在基因水平成功验证了起始于277位点的siRNA能够有效抑制mhIFNAR2的表达，为深入研究mhIFNAR2的功能和机制，尤其是为在乙型肝炎中的研究提供了一个手段。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：陶颖、樊和斌负责课题设计，资料分析，撰写论文；李智、刘艺、桂文甲参与收集数据，修改论文；杨东亮、王宝菊对课题进行指导；樊和斌负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。