细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、基质金属蛋白酶-9和赖氨酸去甲基化酶6B在浸润性乳腺癌组织中的表达及其病理诊断价值

姜 黄，郑丽华，徐小艳，王建君，徐宪伟，王 娜，邢晨菊，鲁显宇

(1.河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院病理科,河南 郑州 450003;2.河南医学高等专科学校人体解剖学教研室,河南 郑州 450000)

在过去20 a中,我国乳腺癌的发病率和病死率呈快速上升趋势[1],虽然手术、放化疗、免疫治疗和联合治疗等手段大大提高了乳腺癌患者的生活质量,但患者的总生存率仍无明显改善,乳腺癌依然严重威胁着女性群体的健康。侵袭和转移是导致乳腺癌患者复发和死亡的主要原因,寻找乳腺癌新的标志物有助于乳腺癌的诊断、治疗和预后判断。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)是一种高度糖基化的单次跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族分子成员,在正常组织中不表达或低表达,在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达,与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关[2-4],可作为预判肿瘤不良预后的因子之一。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)位于染色体20q11.1-13.1,属于基质金属蛋白酶家族,其主要功能是降解细胞外基质,在乳腺癌等多种肿瘤中高表达,对肿瘤的诊疗和预后有重要的临床意义[5]。赖氨酸去甲基化酶6B(lysine demethylase 6B,KDM6B)是赖氨酸27位点三甲基组蛋白H3去甲基化酶,其异常表达与多种肿瘤的发生发展有关,但其在乳腺癌中的表达及生物作用机制尚不完全清楚。目前,关于KDM6B在乳腺癌组织中属于抑癌基因还是促癌基因报道不一,最近的文献表明,KDM6B在乳腺癌中的作用机制是通过促进β-连环蛋白的核内降解来阻止M2型巨噬细胞的极化[6]。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌中的表达情况、这3种蛋白之间的相关性及其在乳腺癌的病理诊断中的价值目前尚未见文献报道。本研究采用免疫组织化学法检测EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达,分析其与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系及三者的相关性,并探讨这3个指标在浸润性乳腺癌病理诊断中的价值,旨在为浸润性乳腺癌的临床病理诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年1月至2017年12月河南中医药大学第五临床医学院/郑州人民医院病理科保存的124例浸润性乳腺癌患者的手术切除活检标本为研究对象。纳入标准:(1)经病理学检查诊断为原发浸润性乳腺癌,组织学类型为浸润性导管癌;(2)女性患者;(3)经过乳腺保乳或乳腺根治性切除术;(4)患者临床资料齐全。排除标准:(1)术前接受放化疗或中医治疗;(2)穿刺标本;(3)转移性乳腺癌。患者年龄29～73岁,其中<50岁者41例,≥50岁者83例;肿瘤直径:≤2 cm者61例,2～5 cm者42例,>5 cm者21例;按照2019年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的Nottingham组织学分级系统标准[7],Ⅰ级19例,Ⅱ级70例,Ⅲ级35例;无淋巴结转移74例,有淋巴结转移50例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ 期54例,Ⅲ～Ⅳ 期70例。另选取同期保存的低级别导管内癌组织标本20例、高级别导管内癌组织标本27例、距离浸润性乳腺癌>1 cm 处癌旁组织标本22例作为对照组。

1.2 主要试剂与仪器

KDM6B一抗兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司,EMMPRIN、MMP-9蛋白一抗兔抗人单克隆抗体、二抗及二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)、抗原修复液、BOX-1002避光免疫组织化学湿盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;BPX-82电热恒温培养箱购自上海博讯医疗生物仪器股份有限公司,HPC-1001不锈钢高压锅购自福州迈新生物技术开发有限公司,Leica DM3000显微镜购自德国Leica公司。

1.3 免疫组织化学法检测乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达

对124例浸润性乳腺癌和对照组标本进行切片(厚 3～4 μm),二甲苯脱蜡,乙醇水化,抗原修复5 min,其中EMMPRIN、MMP-9蛋白使用柠檬酸(pH 6.0)修复, KDM6B使用乙二胺四乙酸修复;滴加 EMMPRIN、MMP-9、KDM6B一抗(滴度均为1200),在免疫组织化学湿盒内37 ℃孵育1.5～2.0 h;用磷酸盐缓冲液洗涤后,滴加二抗(即用型),室温下孵育20～30 min;DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明后封片,显微镜下观察3种抗体在乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中的表达情况,其中EMMPRIN蛋白表达主要定位于细胞膜,染色呈棕黄色;MMP-9蛋白表达主要定位于细胞质,染色呈棕黄色;KDM6B蛋白表达主要定位于细胞核,染色呈棕黄色。采用ImagePro Plus图像分析软件分析EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中的相对表达量:在400倍镜下,从每张切片中取10个着色最强的视野输入计算机,将其转换成灰色照片,导入ImagePro Plus图像分析软件,检测每个阳性细胞的灰度,同时检测相应的10个视野的背景灰度,参照文献[8]的方法计算每张切片的阳性单位(positive unit,PU)值,以PU值代表EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量;实验重复3次,取均值。

1.4 浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白阳性强度与患者临床病理特征的关系分析

通过查询病历资料收集124例浸润性乳腺癌患者的年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、WHO分级、淋巴结转移及TNM分期等一般临床资料,分析浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相对表达量与临床病理特征的关系。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌及浸润性乳腺癌组织中的表达

浸润性乳腺癌组织中的EMMPRIN蛋白表达主要定位于细胞膜,少量定位于细胞质,染色呈棕黄色、强阳性表达,在乳腺间质的纤维细胞中有微弱表达(图1A1);乳腺癌旁组织中EMMPRIN蛋白几乎不表达(图1A2);低级别导管内癌组织中EMMPRIN蛋白呈少量表达(图1A3);高级别导管内癌组织中MMPRIN蛋白呈中等强度表达(图1A4)。MMP-9蛋白表达主要定位于浸润性乳腺癌细胞的细胞质,呈棕黄色、强阳性表达,在乳腺间质的纤维细胞中有少量表达(图1B1);乳腺癌旁组织中MMP-9蛋白呈少量表达(图1B2);低级别导管内癌组织中MMP-9蛋白呈少量表达(图1B3);高级别导管内癌组织中MMP-9蛋白呈中等强度表达(图1B4)。浸润性乳腺癌组织中KDM6B蛋白表达主要定于细胞核,呈棕黄色、弱至中等强度表达,在乳腺间质的纤维细胞中有少量表达(图1C1);乳腺癌旁组织中KDM6B蛋白呈强阳性表达(图1C2);低级别导管内癌组织中KDM6B蛋白呈强阳性表达(图1C3);高级别导管内癌组织中KDM6B蛋白呈弱至中等强度表达(图1C4)。

A1、B1、C1:浸润性乳腺癌;A2、B2、C2:乳腺癌旁组织;A3、B3、C3:低级别导管内癌;A4、B4、C4:高级别导管内癌。

2.2 不同组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相对表达量比较

不同组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量比较差异均有统计学意义(F=75.140、41.860、57.497,P<0.05)。高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于癌旁组织和低级别导管内癌组织,KDM6B蛋白的相对表达量显著低于癌旁组织和低级别导管内癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于高级别导管内癌组织,KDM6B蛋白的相对表达量显著低于高级别导管内癌组织,差异有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌旁组织与低级别导管内癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 不同组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量比较 Tab.1 Comparison of the relative expression of EMMPRIN,MMP-9,and KDM6B protein in different tissues

2.3 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系

EMMPRIN、KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄、肿瘤部位和肿瘤直径无关(P>0.05);MMP-9蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌患者的年龄和肿瘤部位无关(P>0.05);MMP-9蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的肿瘤直径有关(P<0.05)。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相对表达量与浸润性乳腺癌的WHO分级、淋巴结转移、TNM 分期有关(P<0.05);其中在浸润性乳腺癌WHO分级 Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中,EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量依次升高,KDM6B蛋白的相对表达量依次降低,差异有统计学意义(P<0.05);浸润性乳腺癌淋巴结有转移组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于无淋巴结转移组,KDM6B蛋白的相对表达量显著低于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05);TNM分期 Ⅲ～Ⅳ期组EMMPRIN、MMP-9蛋白的相对表达量显著高于Ⅰ～Ⅱ期组,KDM6B蛋白的相对表达量显著低于Ⅰ～Ⅱ期组,差异有统计学意义(P<0.05)。在浸润性乳腺癌肿瘤直径≤2 cm、2～5 cm、>5 cm组中,MMP-9蛋白的相对表达量依次升高,差异有统计学意义(P<0.05);EMMPRIN、KDM6B蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白相对表达量与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系Tab 2 Relationship between relative expression of EMMPRIN,MMP-9,KDM6B protein and clinical pathological characteristics of invasive breast cancer

2.4 浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的相关性

Spearman相关性分析显示,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与MMP-9蛋白的表达呈显著正相关(r=0.990,P=0.000);EMMPRIN与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.606,P=0.000);MMP-9与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关(r=-0.612,P=0.000)。

2.5 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白对浸润性乳腺癌的诊断价值

ROC曲线分析显示,EMMPRIN蛋白诊断浸润性乳腺癌的曲线下面积(area under the curve,AUC)为 0.875[95%置信区间(confidence interval,CI):0.823～0.926,P<0.05],最佳界值为10.043,敏感度为 79.0%,特异度为76.8%。MMP-9诊断浸润性乳腺癌的AUC为 0.863(95%CI:0.808～0.917,P<0.05),最佳界值为10.070,敏感度为74.2%,特异度为76.8%。KDM6B诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.267(95%CI:0.196～0.338,P<0.05),最佳界值为11.003,敏感度为71.0%,特异度为98.6%。结果见图2。

图2 EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白诊断浸润性乳腺癌的ROC曲线Fig.2 ROC curves of EMMPRIN,MMP-9,and KDM6B protein in diagnosing invasive breast cancer

3 讨论

乳腺癌已成为世界上发病率最高的女性恶性肿瘤,是导致女性死亡的第一大恶性肿瘤[9]。乳腺癌的发生发展是多阶段、多因素、多基因共同作用的复杂过程,其侵袭和转移相关机制尚不明确。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在乳腺癌中的定量表达、相关性及病理诊断价值尚未见文献报道。本研究通过免疫组织化学法检测124例浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达情况,采用图像分析技术对上述蛋白进行定量检测,分析其与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系、3种蛋白之间的相关性及其在浸润性乳腺癌中的诊断价值,以期为浸润性乳腺癌的临床病理诊断提供参考。

既往研究显示,EMMPRIN在结直肠癌、非小细胞肺癌、食管癌等肿瘤中的表达与肿瘤的发生发展密切相关[10-12],其高表达提示肿瘤的预后不良。也有研究显示,EMMPRIN在乳腺癌中高表达,与乳腺癌WHO分级、淋巴结转移状况和TNM分期均相关[13]。本研究结果显示,EMMPRIN蛋白在乳腺癌旁组织中几乎不表达,低级别导管内癌组织中 EMMPRIN 蛋白呈少量表达,高级别导管内癌组织中EMMPRIN蛋白呈中等强度表达,浸润性乳腺癌组织中 EMMPRIN蛋白呈高表达;高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN蛋白的相对表达量显著高于乳腺癌旁组织和低级别导管内癌,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN蛋白的相对表达量显著高于高级别导管内癌;浸润性乳腺癌的WHO分级Ⅲ级、淋巴结有转移及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组的EMMPRIN蛋白表达量较高。本研究EMMPRIN蛋白定量研究结果与既往文献研究结果[13]相似,提示EMMPRIN蛋白在乳腺癌侵袭和进展的过程中发挥了促癌作用。

MMP-9能降解细胞外基质而促进肿瘤的浸润和转移,在多种肿瘤中高表达,对肿瘤的预后和治疗有重要的临床意义,研究表明,乳腺癌高表达MMP-9与其浸润转移密切相关[14-15]。本研究结果显示,乳腺癌旁组织和低级别导管内癌组织中MMP-9蛋白呈少量表达,高级别导管内癌组织EMMP-9蛋白呈中等强度表达,浸润性乳腺癌组织中MMP-9蛋白呈高表达;高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中MMP-9蛋白的相对表达量显著高于乳腺癌旁组织和低级别导管内癌,浸润性乳腺癌组织中MMP-9蛋白的相对表达量显著高于高级别导管内癌,乳腺癌旁组织与低级别导管内癌组织中MMP-9蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义;而浸润性乳腺癌患者中,有淋巴结转移者、肿瘤直径较大者、WHO分级Ⅲ级及TNM分期高者的MMP-9蛋白的表达量增加。提示,MMP-9蛋白的高表达与乳腺癌浸润和转移密切相关。

有关KDM6B在乳腺癌中表达的文献报道不一。胡楠等[16]研究表明,KDM6B过表达可抑制乳腺癌细胞的增殖。而吕娟等[17]研究显示,KDM6B蛋白在乳腺癌中的表达显著高于乳腺癌旁组织,其高表达与乳腺癌的TNM分期、雌激素受体表达、孕激素受体表达及淋巴结转移有关。本研究结果显示,高级别导管内癌和浸润性乳腺癌组织中KDM6B蛋白的相对表达量显著低于乳腺癌旁组织和低级别导管内癌,浸润性乳腺癌组织中KDM6B蛋白的相对表达量显著低于高级别导管内癌,且KDM6B蛋白在乳腺癌WHO分级Ⅲ级、淋巴结有转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组中的表达较低,表明KDM6B蛋白抑制了乳腺癌的浸润和转移,在乳腺癌的发生发展中扮演抑癌基因的角色。本研究结果与吕娟等[17]的研究不一致,分析其原因如下:(1)免疫组织化学判读方法不一,本研究采用的是定量判读,而吕娟等[17]采用的是定性判读;(2)可能与选取的乳腺癌组织学类型不同有关,本研究中的浸润性乳腺癌组织学类型为浸润性导管癌,而吕娟等[17]并未阐明其具体研究的是哪一种组织学亚型的乳腺癌;(3)样本量不同,本研究样本量为124例,吕娟等[17]研究中的样本量为47例。

在EMMPRIN、MMP-9和KDM6B三者的关系中,有关EMMPRIN与MMP-9相关性的报道较多,而目前有关EMMPRIN与KDM6B的相关性、MMP-9与KDM6B的相关性尚未见相关文献报道。肿瘤的发生发展是多个癌基因和抑癌基因表达共同协作的结果。研究表明,EMMPRIN高表达能够上调MMPs的表达,并促进肿瘤细胞的浸润、转移及肿瘤血管的形成[18-19];另有研究显示,在结直肠癌、肺腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中,EMMPRIN与MMP-9的表达均呈正相关[20-22]。本研究结果显示,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与MMP-9蛋白表达呈正相关,与上述研究结果一致。另外,本研究结果显示,浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关,MMP-9与KDM6B蛋白的表达呈显著负相关。YU等[23]研究报道,在颈部鳞状细胞癌中,EMMPRIN可以通过激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB) 信号通路促进肿瘤的进展。PARK等[24]在恶性黑色素瘤细胞系研究中发现,KDM6B能够通过NF-κB信号通路促进血管生成和募集巨噬细胞来调节肿瘤微环境,促进肿瘤的进展和转移。而GUARNERI等[25]在皮肤黑色素瘤的研究中发现,NF-κB发挥肿瘤抑制作用与MMP-9的下调有关。以上研究提示,在肿瘤中EMMPRIN和KDM6B均可以通过NF-κB信号通路发挥作用。结合本研究结果,推测在乳腺癌中EMMPRIN过表达和KDM6B低表达可能会导致NF-κB信号通路被显著激活,上调MMP的产生,从而促进肿瘤的发生发展。本研究不足之处在于仅从蛋白水平分析了三者的相关性,尚未涉及分子层面的研究,其具体分子作用机制尚待进一步研究。

本研究对乳腺癌中EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达采用了免疫组织化学定量检测方法[8],能够比较直观地反映免疫组织化学指标的表达水平。本研究ROC曲线结果显示,EMMPRIN蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.875,最佳界值为10.043,敏感度为 79.0%,特异度为76.8%;MMP-9蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.863,最佳界值为10.070,敏感度为 74.2%,特异度为76.8%;KDM6B蛋白诊断浸润性乳腺癌的AUC为0.267,最佳界值为11.003,敏感度为 71.0%,特异度为98.6%。EMMPRIN、MMP-9蛋白表达水平越高、KDM6B蛋白表达水平越低,病理组织学诊断浸润性乳腺癌的可能性越大。由于肿瘤病因的多样性和复杂性,任何检测方法或技术都不可能完全实现对肿瘤的诊断,因此,EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白在诊断乳腺癌时应结合其形态学和其他免疫组织化学标志物综合判断。

4 结论

EMMPRIN、MMP-9蛋白在浸润性乳腺癌癌旁组织、低级别导管内癌、高级别导管内癌和浸润性癌组织中的表达依次升高,KDM6B蛋白的表达则依次降低。EMMPRIN、MMP-9蛋白表达量高提示浸润性乳腺癌WHO分级高、淋巴结容易转移、TNM 分期高;KDM6B蛋白表达量高提示浸润性乳腺癌WHO分级低、淋巴结不易转移、TNM分期低;MMP-9蛋白表达量越高还提示肿瘤直径越大。浸润性乳腺癌组织中EMMPRIN与MMP-9蛋白呈正相关,EMMPRIN与KDM6B蛋白呈负相关,MMP-9与KDM6B蛋白呈负相关。EMMPRIN、MMP-9蛋白表达水平越高、KDM6B蛋白表达水平越低,病理组织学诊断浸润性乳腺癌的可能性越大。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白与浸润性乳腺癌发生发展有关,检测EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白的表达有助于浸润性乳腺癌的病理诊断及临床判断浸润转移。EMMPRIN、MMP-9和KDM6B蛋白三者之间相关性的研究为浸润性乳腺癌相关信号通路机制的研究提供了一定的参考依据,其具体分子作用机制有待后续研究。