改进QuEChERS-液质联用法测定黄精中23种农药残留

何华军，张辉，夏丽敏，王远远

(1.景宁畲族自治县食品药品检验检测中心，浙江 丽水 323500；2.景宁畲族自治县生态林业发展中心，浙江 丽水 323500；3.浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310051)

黄精，习称鸡头参、老虎姜、九蒸姜、野山姜、千年运等，为百合科黄精属的多年生草本植物，以根茎入药，是我国传统的“药食同源”滋补中药材之一，具有悠久的药用历史和确切的临床疗效[1]。浙江省作为黄精主产区之一，拥有优越的林业生态资源，尤其是林下自然环境[2]。近几年黄精的人工种植规模不断扩大，种植过程中也出现了各种病虫害问题，并有愈发严重的趋势[3]。在黄精种植过程中化肥农药不规范、超量使用现象仍然较多，存在较大的环境污染和农药残留风险[4-5]。因此，《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则农药残留量测定法(2341)[6]新增了第五法“药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法”，进一步规范和限制中药材种植过程的农药使用，推动中医药市场健康发展。

液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)作为农药多残留检测方法之一，适用于分析受热易分解、分子量较大、不适用于气相色谱分析的农药[7-8]，该检测方法灵敏度高，定性定量检测可以同时进行，检测结果准确。QuEChERS方法作为一种操作快速、高效、简单的样品萃取与基质净化技术，最初由美国农业部Anastassiades等[9]开发，该方法因其简单和高通量而被广泛接受，而且大多数农药的回收率较高[10]。但中药材的基质复杂、杂质多、干扰多，传统的QuEChERS方法并不能适用于各种不同基质的药材，因此，需要针对部分药材基质对该方法进行优化，以获得最佳的检测条件[11-13]。

本文以丽水市黄精种植企业生产的黄精为研究对象，以《中华人民共和国药典》 (2020年版)四部通则为指导，利用改进QuEChERS方法对黄精样品进行提取净化，采用UPLC-MS/MS法同时对23种农药残留进行了测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQS 三重四级杆串联质谱仪：美国Waters公司；ST-16R 高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；XH-B 漩涡混合器：江苏天翎仪器有限公司；PP020XXM1 超纯水器：英国ELGA公司；GM 200刀式研磨仪：弗尔德(上海)仪器设备有限公司；ME 104电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。

23种农药标准品(浓度为1 000 mg·L-1)：氧乐果、多菌灵、噻虫嗪、吡虫啉、乐果、啶虫脒、嘧霉胺、烯酰吗啉、腈菌唑、嘧菌酯、氟环唑、联苯肼酯、马拉硫磷、三唑磷、咪鲜胺、倍硫磷、二嗪农、辛硫磷、茚虫威、丙溴磷、增效醚、毒死蜱、哒螨灵，均由坛墨质检科技股份有限公司提供。

乙腈(色谱级)：德国默克公司；甲酸(色谱级)、QuEChERS提取盐包(6 g无水硫酸镁，1.5 g无水乙酸钠)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；乙酸铵(分析纯)：上海展云化工有限公司；冰醋酸(分析纯)：江苏强盛功能化学股份有限公司；无水硫酸镁(MgSO4，分析纯)：南京化学试剂股份有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，40～63 μm)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18，40～63 μm)、石墨化碳黑(GCB，120～400目)、硅胶(48～74 μm)：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

取23种标准农药物质各1.0 mL分别加入到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成质量浓度均为100 μg·mL-1的标准储备液，-18 ℃避光冷藏保存。取空白黄精基质，梯度稀释至不同质量浓度(0.5、1、5、10、20、50 ng·mL-1)的溶液，即得。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Waters HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：40 ℃；流速：0.45 mL·min-1；流动相A：乙腈-0.1%甲酸溶液；流动相B：0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L-1甲酸铵)；洗脱：0～0.25 min，2%A；0.25～7.75 min，2%～99%A；7.75～8.5 min，2%A；8.50～10.00 min，2%A。

1.3.2 质谱条件

以Waters Xevo TQS LC-MS-MS联用仪检测，电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)；正离子扫描模式；多反应监测(multi reaction monitoring，MRM)；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂(氮气)流速：1 000 L·h-1；温度：450 ℃。

1.4 试验方法

1.4.1 供试品溶液的制备

取供试品粉末(过孔径0.25 mm筛)3 g，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，静置30 min，精密加入乙腈15 mL，涡旋混匀，置恒温振荡器中振荡5 min，加入QuEChERS提取盐包，立即摇散，再置恒温振荡器于5 ℃下振荡5 min，离心(5 ℃，5 000 r·min-1)5 min，取上清液9 mL于预先装有C18(300 mg)、PSA(300 mg)、硅胶(100 mg)的15 mL净化管中，涡旋混匀，置恒温振荡器振荡5 min，离心(5 000 r·min-1)5 min，取上清液过0.22 μm滤膜，即得。

1.4.2 空白基质液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法(1.4.1节)处理成空白基质溶液。

2 结果与分析

2.1 LC-MS/MS条件的选择

用适宜浓度的标准溶液，通过LC-MS/MS 的Intellistart调谐程序，优化锥孔电压和碰撞能量，选择相对丰度较高、出峰稳定的离子碎片，获得了23种农药最优质谱检测参数，如表1所示。23种农药目标物的总离子流图如图1所示。

图1 23种农药MRM总离子流图Fig.1 MRM total ion flow diagram of 23 pesticides

表1 23种农药的质谱参数及液相保留时间Table 1 Mass spectrometry parameters and liquid phase retention time of 23 pesticides

2.2 QuEChERS法的优化

2.2.1 GCB对23种农药吸附的影响

GCB作为常用的QuEChERS净化吸附剂有去除色素的作用，如类胡萝卜素和叶绿素，但它们二者对含苯官能团的化合物有较强吸附作用，会降低其回收率[14]。因此，本试验对空白黄精样品进行加标，比较其加标回收率，加标量为50 μg·kg-1，在含有900 mg无水硫酸镁、300 mg PSA、300 mg C18、300 mg硅胶净化条件下分别考察了不同GCB使用量下(0、30、60和90 mg)23种农药回收率的影响，结果见图2。如图2所示，多菌灵、嘧霉胺、联苯肼酯、咪鲜胺、毒死蜱的回收率随着GCB用量的增加明显下降，可能与其较强的吸附作用有关。当GCB用量为0时，剩余农药的回收率相比其他3组差别不大，因此，本试验不使用GCB作为净化材料。

图2 不同GCB使用量下23种农药回收率Fig.2 Recovery rates of 23 pesticides under different GCB usage levels

2.2.2 硅胶对23种农药吸附的影响

由于在单独使用PSA或者C18作为净化剂时，乐果、马拉硫磷、辛硫磷、咪鲜胺等多种农药的回收率明显受到净化条件的影响，不符合检测要求，为进一步探寻成本更低，更加绿色的检测方法，本试验在含有900 mg无水硫酸镁、300 mgPSA、300 mgC18净化条件下分别考察了不同硅胶使用量下(0、100、200和300 mg)23种农药回收率的影响，结果见图3。如图3所示，当硅胶使用量为0时，辛硫磷回收率较低，其他3组各农药回收率相差较小，且都能满足检测要求，考虑到试验成本，选择硅胶用量100 mg为最佳条件。

图3 不同硅胶使用量下23种农药回收率Fig.3 Recovery rates of 23 pesticides under different silicone usage levels

综上所述，当无水硫酸镁(900 mg)、PSA(300 mg)、C18(300 mg)、硅胶(100 mg)组合作为净化剂时，23种农药的回收率在77.49%～107.11%，满足农残检测的要求，检测成本也更低。因此，本实验选择该组合作为净化剂。

2.3 基质效应

基质效应是由于不同化合物在LC-MS/MS分析中对电喷雾界面的电离效率会有不同的影响，这种影响表现为离子增强或抑制，容易导致检测结果有不同程度的误差。本试验的基质效应(ME)根据公式“ME等于基质匹配标准曲线的斜率除以溶剂标准曲线的斜率减去1再乘以100%”进行评估，当ME>0时，表现为基质增强效应；当ME<0时，为基质抑制效应。此外，若|ME|≤20%，表示弱基质效应；若|ME|在20%～50%，则表示中等基质效应；若|ME|>50%，表示强基质效应[15-16]。结果见表2，在黄精基质中嘧霉胺具有强基质效应，吡虫啉和联苯肼酯具有中等基质效应，其余农药具有弱基质效应。本试验采用黄精基质匹配标准溶液绘制的标准校正曲线对黄精中23种农药定量，降低基质效应的影响，提高检测结果准确性。

表2 23种农药的线性方程、 相关系数、 基质效应、 检出限和定量限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，matrix effects，detection limits，and quantification limits of 23 pesticides

2.4 方法学验证

本试验采用基质匹配外标法定量，将一定量的混合标准工作溶液用空白基质液梯度稀释成6个浓度的标准工作溶液，根据色谱条件测定混合标准工作溶液，绘制23种农药的基质匹配标准曲线。以信噪比S/N=3时确定检测限(LOD)，以信噪比S/N=10时确定定量限(LOQ)。

23种农药的线性范围、相关系数、定量限、检出限见表2。

23种农药化合物的标准曲线浓度范围为0.5～50.0 ng·mL-1，线性相关系数(R2)均大于0.995 5，23种农药化合物的LOQs和LODs分别为0.04～3.29 μg·kg-1和0.01～0.99 μg·kg-1，检出限均低于《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则农药残留量测定法(2341)第五法，可以满足检测要求。

在黄精空白基质中加入低(10 μg·kg-1)、中(25 μg·kg-1)、高(100 μg·kg-1)3个不同浓度水平的混合标准品，按照1.4.1节进行样品前处理，测定回收率，计算相对标准偏差(RSDs)，结果见表3。3个不同浓度水平下的加标回收率分别为83.36%～114.52%、75.61%～101.38%、82.29%～103.15%，RSDs 分别为1.26%～9.99%、0.61%～7.08%、0.64%～4.43%，方法回收率和精密度均满足农药残留检测要求。

表3 黄精基质中23种农药的加标回收率及相对标准偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 23 pesticides in Polygonatum sibiricum matrix

3 结论与讨论

本文通过对净化条件、质谱条件等优化，确定黄精中23种农药多残留的 QuEChERS前处理方法，方法学考察结果显示，23种农药的 LOD为0.01～0.99 μg·kg-1，LOQ为 0.04～3.29 μg·kg-1，标准曲线R2在0.995 5～0.999 9，加标回收率在75.61%～114.52%，RSD在0.61%～9.99%。本文所建立的检测方法操作简便、高效灵敏、准确可靠，可为黄精中相关农药的残留监测提供技术支撑。