海南红树林底泥海洋放线菌的抗菌及抗群体感应活性筛选

莫 杰, 钱生辉, 钱嘉兴, 缪 莉

(扬州大学环境科学与工程学院, 扬州 225127)

抗生素的广泛使用导致环境中抗生素残留。在抗生素的长期选择压力下,病原菌易产生耐药性,使用抗生素治疗细菌感染的效果也会渐渐减弱。研究发现,病原菌会以各种途径分泌化学信号分子来检测菌群密度和调控细菌的多种生理机能,如抗生素的合成[1]、发光、毒性因子的释放[2]、胞外多糖的合成和分泌、细菌的聚集、生物膜的形成以及质粒的转移等,从而适应周围环境变化,这种信息交流系统称为细菌群体感应系统[3]。在不影响细菌正常生命活动的前提下,可以对这种细菌之间的信息交流起阻断作用,干扰或抑制细菌群体感应现象的物质称为群体感应抑制剂[4]。如果能找到合适的群体感应抑制剂,就能在不杀死细菌的情况下降低细菌的致病性,减少耐药性的产生。

海洋放线菌是天然活性物质的重要来源。海洋环境复杂多变,高压、高盐和其他极端环境使海洋放线菌的物种更加丰富,更容易分离和筛选新的放线菌[5]。由于海洋沉积环境的特殊性,海洋放线菌具有特殊的生理特性和功能,可产生许多结构新颖、功能独特的活性物质[6],为开发海洋药物提供了丰富的先导化合物资源。因此,海洋放线菌的生物活性及天然活性物质研究一直受到关注。仅2013—2018年报道的海洋放线菌来源的天然产物约有470个,且半数为新化合物[7]。余海[8]从两株海洋放线菌中分离获得30个化合物,其中就有15个新型化合物。所以,新颖次级代谢产物的发现和新药开发也是目前海洋放线菌资源研究最大的驱动力[9]。

红树林生态系统是分布于热带、亚热带海岸潮间带的木本植物群落,是陆地与海洋过渡带[10]。特殊的生态环境、周期性的海水侵袭、河口有机质的沉积和落叶的腐败作用使其富含有机质和腐殖质,蕴含了极其丰富的微生物资源[11],具有多种生物学活性。因此,从红树林底泥中亦可能找到很多具有抗群体感应活性和抗菌活性的菌株。本文以紫色色杆菌为抗群体感应活性测试的指示菌,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等5株耐药菌为抗菌活性测试的指示菌,对实验室保存的从海南红树林底泥样品中分离到的放线菌进行抗菌和抗群体感应活性筛选,以期筛选出具有较强抗群体感应活性但抗菌活性相对较弱的菌株,并对活性菌株的代谢产物进行初步的化学分析,为抗群体感应活性物质的开发提供优良菌源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源与指示菌

本实验所有待筛选的海洋放线菌均分离自海南红树林保护区的红树林底泥样品。指示菌紫色色杆菌(ChromobactieriumviolaceumATCC 12472)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和3株金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 43300,S.aureusATCC 33591,S.aureusATCC 25923)为实验室保存菌种。

1.1.2 培养基

高氏一号培养基(1.0 L):可溶性淀粉20.0 g、硝酸钾1.0 g、氯化钠0.5 g、磷酸氢二钾0.5 g、七水合硫酸镁0.5 g、七水合硫酸铁0.01 g、海盐33.0 g,pH 7.4～7.6。

Luria-Bertani(LB)培养基(1.0 L):胰蛋白胨10.0 g、酵母5.0 g、氯化钠10.0 g, pH 7.0～7.2。

所有固体培养基添加15～20 g的琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 放线菌发酵培养及代谢物提取

洪都拉斯是位于中美洲的一个低中等收入国家。2004年的人均国民收入为1030美元。同年，总人口710万的46%的居民居住在城市。洪都拉斯的两个主要中心城市，一个是首都特古西加尔巴，另一个是国家工业化程度最高的城市圣佩德罗苏拉，合计约150万人。这两个城市对新鲜果蔬的需求，基本推动了新鲜果蔬供应链的变化。它们都有多数超市卖场和食品服务，这些都对新鲜果蔬有定期的特定要求。此外，一些农副食品企业也正在向位于两个主要中心城市中间和周围低人口城镇转移。

将分离得到的菌株接种到50 mL高氏一号液体培养基中,放入恒温摇床,30 ℃、140 r/min培养3 d。吸取10 mL培养好的菌液接种到200 mL高氏一号培养基中, 30 ℃、140 r/min继续培养7 d。将培养好的菌液用8层纱布过滤,滤液用乙酸乙酯萃取两遍,取上清液进行蒸发浓缩,用甲醇将浓缩蒸发的粗提物转移到1.5 mL的指形管中,吹干称重。根据粗提物的质量加入一定量乙酸乙酯配制成50 mg/mL的粗提物样品液,用于活性测试。

1.2.2 滤纸片法测定菌株粗提物活性

将保存的6株指示菌菌种接入LB液体培养基培养2 d。吸取200 μL指示菌菌液于LB固体培养基上,用棉签均匀涂布。吸取5 μL粗提物样品液滴加至滤纸片(6 mm)上,使滤纸片上的含样量为250 μg。将风干后的滤纸片倒扣在涂有指示菌的培养基上。将培养皿封口后倒置于30 ℃恒温培养箱中培养1 d,测量抑菌圈直径,表征抗菌能力大小。以紫色色杆菌为指示菌时,产生的色素抑菌圈分为透明圈和模糊圈。透明圈表示代谢产物具有抗菌活性,模糊圈表示代谢产物不抑制菌体生长仅抑制紫色素产生,具有抗群体感应活性。

1.2.3 色素抑制法测定菌株粗提物活性

将保存的紫色色杆菌(C.violaceumATCC 12472)接入LB液体培养基中30 ℃、140 r/min振荡培养2 d。将粗提物样品液取出部分到1.5 mL的指形管中,吹干称重,并加入一定量的DMSO使其浓度为50 mg/mL。在试管中加入LB培养基950 μL和紫色色杆菌菌液50 μL,再分别加入2 μL和4 μL的样品,使其质量浓度为100 μg/mL和200 μg/mL,每个浓度做两组平行。阴性对照中加入与样品液等量的DMSO。将所有试管放入30 ℃、140 r/min摇床培养2 d后拍照记录。将所有试管中的液体取出放入1.5 mL指形管中14 000 r/min离心15 min。倒出上清液,向指形管中加入200 μL的DMSO溶解紫色色素,充分溶解后继续14 000 r/min离心15 min。依次吸取100 μL的溶解液的上清液加入到96孔板中,酶标仪测定波长570 nm处的吸光度OD值。数值大小与紫色色杆菌色素的产量成正比,利用以下公式计算粗提物对紫色色杆菌紫色素的产生是否有抑制作用。

1.2.4 薄层层析分析(TLC)

将菌株粗提物用适量甲醇溶解,裁选适当大小的HSGF254荧光薄层层析硅胶板,并用铅笔在距薄层板上下两端0.5 cm处轻轻划一道横线,选用内径约为0.5 mm的毛细管,轻轻蘸取少量样品溶液,点到HSGF254荧光薄层层析硅胶板下层横线上,选用二氯甲烷-甲醇(体积比20∶1)体系作为展开剂,将展开剂倒入层析缸,密闭摇匀,将点好的薄层板放入层析缸中,当溶剂水平面上移到上端横线时取出,用冷风吹干,涂抹浓硫酸香草醛显色剂,烤干并拍照记录。

按照生工SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取放线菌的基因组DNA;采用细菌16S rDNA的通用引物7f (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540r(1522) (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′),对提取到的放线菌基因组DNA进行PCR扩增,PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃ 变性35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃ 延伸1 min 30 s,35个循环;72 ℃再延伸8 min。扩增所得到的16S rDNA片段经纯度检测后,交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序;将所得序列提交GenBank进行序列比对,根据比对结果,选择相近的菌株采用Clustal和MegaX软件绘制系统发育树,并将菌种与EzBioCloud database中的标准菌株进行比对。

1.2.6 代谢产物初步分析及GC-MS分析

将粗提物用二氯甲烷/甲醇1∶1溶解后加样到正相固相小柱(Supelclean LC-Si),待溶剂挥干后,依次以石油醚/乙酸乙酯(30∶1、15∶1、1∶1)、二氯甲烷/甲醇(20∶1、10∶1、1∶1)进行洗脱,每次3个柱体积,收集洗脱液,浓缩后进行活性测试和GC-MS分析。

气相条件:采用DB-5MS弱极性色谱柱(规格30 m×0.25 mm×0.25 μm),进样量1 μL,柱流速1 mL/min,起始温度50 ℃,以7 ℃/min升到200 ℃,保持3 min,再以7 ℃/min升到280 ℃,保持15 min。

MS运行条件:运用EI离子源,离子源温度为250 ℃,质量扫描范围为50～650 amu。

2 结果与分析

2.1 活性初筛

运用滤纸片法对提取到的放线菌粗提物进行群体感应抑制活性和抗菌活性筛选,其中,阳性对照为0.25 mg的青霉素,粗提物质量为250 μg。共选取84株放线菌进行发酵及其代谢产物的活性初筛。结果(图1)显示,指示菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC 25923和紫色色杆菌具有较高的敏感性,各有20株以上的放线菌对这3株指示菌有抑制作用,其中,抑制圈直径大于18 mm的高活性菌株数分别为8株、7株和1株。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌ATCC 43300和金黄色葡萄球菌ATCC 33591的抗性较强,仅有5株左右的放线菌对这3株指示菌表现出一定的抗菌活性。有43株放线菌至少对一株指示菌有抑制作用,占所有待测菌株的51.19%;有27株放线菌对两株及两株以上指示菌同时有抑制作用,占待测菌株的32.14%。其中,HN1-104、HN2-56、HN2-90对3株指示菌有抑制作用,HN1-121、HN2-57、HN2-103对4株指示菌有抑制作用,HN1-122对5株指示菌有抑制作用,HN1-65、HN1-138和HN1-146对6株指示菌都有抑制作用。在所有待测菌株中有8株放线菌具有抗群体感应活性(它们对紫色色杆菌产生的色素抑制圈为模糊圈),其中,HN2-56的抗群体感应活性最好,色素抑制圈直径达20 mm。

1～6分别为紫色色杆菌(Chromobactierium violaceum ATCC 12472)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和3株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 43300、S. aureus ATCC 33591、S. aureus ATCC 25923)。图1 红树林底泥放线菌对不同指示菌的抑制Figure 1 Inhibition of actinomycetes from mangrove sediment against different indicator bacteria

2.2 活性复筛

从初筛的抗菌及抗群体感应实验中选取至少对3株指示菌有抑制作用的10株放线菌进行紫色色杆菌色素抑制活性的复筛。结果显示,当放线菌粗提物质量浓度为100 μg/mL时,HN2-56、HN1-104、HN2-57、HN2-103和HN1-122的色素抑制率均超过50%;当放线菌粗提物质量浓度为200 μg/mL时,HN2-56、HN1-122、HN2-57和HN2-103的色素抑制率均超过60%。大多数菌株的粗提物在高质量浓度时,色素抑制率比低质量浓度时有所提高。有些初筛高活性的菌株在复筛中对紫色色杆菌的色素抑制效果并不明显,如菌株HN1-138虽然对6株指示菌都有抑制作用,但是其色素抑制率还不到10%(图2)。

图2 活性菌株对紫色色杆菌产色素的抑制Figure 2 Inhibition of selected strains against the pigment production by Chromobactierium violaceum

2.3 薄层层析(TLC)分析

为检测菌株的化学多样性,对复筛的10株菌株的粗提物进行TLC分析,溶剂体系为二氯甲烷-甲醇(体积比20∶1),结果如图3所示。菌株HN2-56、HN1-104、HN1-146和HN1-65的粗提物在薄层板上的斑点数量较多,代谢产物较为丰富。

从左向右依次为菌株HN2-56、HN2-57、HN2-90、HN2-103、HN1-65、HN1-104、HN1-121、HN1-122、HN1-138、HN1-146。图3 活性菌株的薄层层析(TLC)分析Figure 3 Thin layer chromatography (TLC) analysis of active strains

根据初筛、复筛以及TLC分析结果发现,菌株HN2-56代谢产物丰富、具有较高且稳定的抗群体感应活性和较弱的抗菌活性,是研究抗群体感应活性产物的良好菌株,因此,对其进行代谢产物初步分离鉴定以及菌株鉴定。

2.4 菌株HN2-56代谢产物初步分离及GC-MS分析

采用正相固相小柱对菌株HN2-56的粗提物进行初步分离,以石油醚/乙酸乙酯体系和二氯甲烷/甲醇体系按极性从低到高分步洗脱,收集各洗脱液,浓缩后测试各组分活性。根据活性测试结果对石油醚/乙酸乙酯1∶1洗脱所得到的活性组分进行GC-MS分析。结果显示,活性组分中存在超过13个可能的化合物,其中,8个化合物已被报道具有不同的生物活性,包括杀虫、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗流感、抗炎等活性(表1)。活性组分中占比较高的化合物是油酸酰胺(20.15%)、邻苯二甲酸二丁酯(16.07%)和二乙基甲苯甲酰胺(11.7%)。采用滤纸片法,对其中8个化合物(化合物1、4、6、7、8、9、10和12)进行抗菌及抗群体感应活性测试,滤纸片上各化合物含量100 μg。结果显示,化合物4(二乙基甲苯甲酰胺)和12(莪术烯醇)具有抗群体感应活性。在测试浓度下,二乙基甲苯甲酰胺对紫色色杆菌的色素抑制圈直径为12.5 mm,莪术烯醇的活性较弱,其色素抑制圈直径为7 mm。同时还测定了这8个化合物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌(ATCC 43300、ATCC 25923)的抗菌活性,发现化合物6(邻苯二甲酸二丁酯)和7(2,5-二叔丁基邻苯醌)对3株指示菌均具有很强的抗菌活性。

表1 HN2-56的石油醚/乙酸乙酯1∶1组分的GC-MS峰特征分析Table 1 Characteristics of the peaks obtained by GC-MS analysis of the petroleum ether/ethyl acetate 1∶1 fraction of HN2-56

2.5 菌株HN2-56鉴定

菌株HN2-56在高氏一号培养基上生长情况良好(图4),培养7 d后其菌落直径在3～5 mm,气生菌丝白色,基内菌丝淡黄色。提取菌株HN2-56的基因组DNA,扩增其16S rDNA并测序,将所得rDNA序列输入GenBank数据库,进行Blast分析。选取12株与HN2-56序列相似性在98%以上的不同菌株,运用MegaX软件的Neighbor-Joining建立系统发育树(图5)。结果表明,HN2-56是一株链霉菌,与Streptomyceschumphonesisstrain KK1-2 (NR_126175.1)的序列在EzBioCloud database进行比对同源性为99.86%,对比文献[20],HN2-56的培养特征也与该菌株十分相似,所以将HN2-56鉴定为StreptomyceschumphonesisHN2-56(ON430586)。

图4 菌株HN2-56的菌落照片Figure 4 The colony picture of strain HN2-56

图5 菌株HN2-56的系统发育树 Figure 5 Phylogenetic tree of strain HN2-56

3 讨论与结论

细菌耐药性上升的原因与抗生素的滥用和有限的药物靶点相关。因此,开发具有不同药物靶点的新型抗生素已成为新药研究的热点。针对细菌的生物膜形成和群体感应效应的抗感染活性筛选亦是两个重要的研究方向。作用于群体感应系统的化合物,不会对病原菌造成太大的生存压力,不容易使病原菌产生耐药性,可以与传统抗生素一起协同治疗细菌性感染。Arendse等[21]合成了5个新型咪唑衍生物,采用不同的生物信息学和体外实验技术,测试了它们对紫色色杆菌的抗菌和抗群体感应活性,结果证实了化合物能够有效地结合CviR并抑制群体感应效应。香芹酮是一种天然的单萜类物质,在60～70 μg/mL质量浓度下对紫色色杆菌有明显抗群体感应作用,相同浓度下也能抑制80%以上的生物膜形成,电子显微镜下香芹酮处理显示不仅生物膜密度减少,还破坏了生物膜基质[22]。Batohi等[23]发现柠檬醛及其衍生物对紫色色杆菌具有抗群体感应作用。研究发现,细菌生物膜的形成与群体感应效应密切相关[24]。本文仅研究了放线菌提取物对紫色色杆菌产色素的抗群体感应效应,并未深入研究其对细菌生物膜形成的影响,有待后续研究。

本文筛选得到的菌株HN2-56与Streptomyceschumphonensisstrain KK1-2(NR126175.1)[20]极为相似。Su等[25]报道菌株StreptomyceschumphonensisSCSIO15079能产生具有降血脂活性的芳香酸和亮氨酸衍生物。本研究通过GC-MS分析发现,HN2-56的活性组分中可能存在较高含量的油酸酰胺(抗氧化活性)、邻苯二甲酸二丁酯(抗菌抗肿瘤活性)和二乙基甲苯甲酰胺(杀虫活性)等活性化合物,为后续研究提供了参考。通过活性验证试验发现,二乙基甲苯甲酰胺具有一定的抗群体感应活性,鉴于其在活性部位的含量较高,推断该化合物可能是菌株HN2-56中的一个抗群体感应活性成分。

本研究发酵并测试了84株海南红树林底泥放线菌对多株指示菌的抗菌和抗群体感应活性,其中,43株具有一定的活性,筛出率为51.19%。从活性菌株中挑选10株活性较好的菌株进行复筛发现,菌株HN2-56、HN1-104、HN1-122、HN2-103和HN1-146活性较为突出。综合比较活性测试及化学分析结果显示,菌株HN2-56代谢产物较为丰富,具有很好的群体感应抑制效应且抗菌活性较弱。对该菌的代谢产物进行初步分离,通过GC-MS分析,从其活性组分中鉴定出13个可能的化合物,经活性验证发现二乙基甲苯甲酰胺和莪术烯醇具有抗群体感应活性。该菌在抗群体感应方面具有较高的研究价值,在后续实验中将进一步研究其培养条件和活性代谢产物,为群体感应抑制剂的开发提供基础。