一种适用于实验教学的果蝇DNA提取新方法

魏 远, 王宏刚, 朱玉山, 李艳君

(南开大学生物国家级实验教学示范中心, 天津 300071)

果蝇是遗传学科研和教学中被普遍使用的模式生物,具有染色体少、已定位的基因数多、突变性状多等优点,是研究基因分离、连锁交换、基因表达与调节的理想材料[1-2]。提取果蝇DNA并对其特定基因片段扩增是多个实验项目中的必要步骤,被广泛应用于各种基础性或综合开放性遗传学实验课程[3-5]。

提取DNA的质量直接影响后续PCR扩增、限制性酶切及基因测序等实验效果[6-9]。采用常规昆虫DNA提取方法提取果蝇DNA,耗时较长、成本较高,提取效果不稳定,不适用于本科实验教学[10-11]。南开大学遗传学实验课程组将科研中常用的动物组织DNA提取方法改造后用于实验教学,建立了一种高效提取果蝇DNA新方法,取得了良好的教学效果。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验中的果蝇携带YAP基因,来源于南开大学吴世安教授实验室。

1.2 方法

1.2.1 常规方法一提取果蝇DNA

将两只果蝇麻醉后置于1.5 mL EP管中;加入50 μL含proteinase K(质量浓度20 mg/mL)的Squishing Buffer(SB)缓冲液后用研磨棒将果蝇充分研磨,如沾壁可稍离心;置37 ℃金属浴孵育30 min,转入95 ℃金属浴孵育2 min;10 000 r/min离心3 min,取上清液作为DNA模板。

1.2.2 常规方法二提取果蝇DNA

用剪刀将100 μL移液器枪头的尖部剪去少许后,用移液器吸取50 μL质量分数为5%的Chelex-100溶液(预先摇匀)到EP管中,另加入2 μL的proteinase K(质量浓度20 mg/mL);取两只麻醉后的果蝇于EP管中,用研磨棒充分研磨,涡旋振荡30 s,于1 000 r/min离心1 min混匀;将EP管置于56 ℃恒温水浴锅中水浴6 h,再转入95 ℃水浴3 min,14 000 r/min离心3 min,取上清液作为DNA模板。

1.2.3 高效法提取果蝇DNA

取两只麻醉后的果蝇于1.5 mL EP管中,加入50 μL NaOH碱裂解液(浓度100 mmol/L,pH 12),用研磨棒将果蝇充分研磨60 s,使果蝇虫体被全部碾碎;将EP管放入干式恒温器中100 ℃孵育10 min;之后加入50 μL Tris-HCL(浓度40 mmol/L)与原液充分混匀,经10 000 r/min离心2 min,取上清液作为DNA模板。

1.3 DNA质量浓度及纯度检测

3种提取方法各设3次重复实验即得到9份样品,分别取1 μL DNA使用DNA NanoDrop 2 000 C超微量分光光度计测定DNA质量浓度、A260/A280和A260/A230,比较3种方法提取DNA的质量浓度和杂质情况。数据采用平均值±标准差表示,并进行单因素方差分析,α=0.05。

1.4 PCR扩增

对提取DNA的YAP序列进行PCR扩增。引物序列上游为TGAAACAGCAAGAACTGCTTC;下游为 CACCACTGCTCCCATTCA。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系20 μL,其中,含DNA模板0.4 μL,上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),ddH2O 8.8 μL,TaqMaster Mix 10 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性 3 min;95 ℃变性15 s, 56 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃再延伸2 min,最后保持10 ℃。PCR仪为德国 Eppendorf公司。

1.5 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

取扩增后的9份PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,评价3种方法提取的基因组DNA的PCR扩增效率。样品量8 μL,DNA Marker 3 μL,核酸染料为GelRed 3 μL,电压100 V,电泳时间20 min。DNA Marker DL 2000购于TaKaRa公司。通过凝胶成像仪(UVITEC cambridge)成像。

2 实验结果

2.1 DNA质量浓度及纯度检测

统计DNA质量浓度、A260/A280、A260/A230、提取时长及成本数据(表1)。高效法提取的DNA质量浓度约670 ng/μL,与常规方法一提取量相似,浓度较高,且重复实验的方差小,提取效果最稳定;常规方法二提取的DNA质量浓度较低且数据方差大,提取效果不稳定,与高效法相比差异显著(P<0.01,图1)。

** 表示P<0.01; ns 表示无显著差异。图1 3种方法提取DNA浓度显著性分析Figure 1 Significance analysis diagram of concentrations of three methods of extracting DNA

表1 3种方法提取果蝇基因组DNA的质量浓度及A260/A280和A260/A230Table 1 DNA concentrations and A260/A280 and A260/A230 of three methods of extracting DNA from Drosophila melanogaster

通过测定A260/A280判断样品中蛋白质污染情况,纯度较高的DNA的A260/A280在1.6～1.8,低于此范围表明蛋白质含量超标,高于此范围表明样品中含有RNA。高效法提取样品的A260/A280约为1.6,表明DNA纯度较高,蛋白污染较小,且方差最小,重复性最好;常规方法一和常规方法二所提取样品的A260/A280均低于1.3(表1),表明有蛋白质污染,与高效法相比差异显著(P<0.01,图2)。

** 表示P< 0.01; ns 表示无显著差异。图2 3种方法提取DNA 的A260/A280和A260/A230显著性分析Figure 2 Significance analysis diagram of A260/A280 and A260/A230 of three methods of extracting DNA

通过A260/A230值判断样品中盐离子干扰情况,若A260/A230小于2.0,表明有小分子和盐类干扰。实验表明,3种方法提取的DNA样品中盐离子均较多。

2.2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测

对YAP基因片段进行PCR扩增,3种提取方法获得的DNA扩增产物的电泳条带都比较明亮且单一,在1 000～1 500 bp (图3)。3种提取方法获得的DNA样品都满足实验需求。

M:DNA Marker;1～3:常规方法一提取DNA扩增产物;4～6:常规方法二提取DNA扩增产物;7～9:高效法提取DNA扩增产物。图3 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Figure 3 Electrophoresis of PCR products of DNA

3 讨论与结论

3.1 提取DNA的质量

通过测定DNA浓度、纯度以及检测PCR扩增效果,判定提取DNA的质量。本文选用的3种方法提取果蝇DNA的质量均满足实验需求,且高效法提取DNA的浓度和纯度与常规方法相比质量较高,且方差较小,重复性好,满足实验需求。常规方法二所使用的Chelex-100溶液的可溶性低,不同学生取液的浓度有误差,导致DNA提取浓度不同,数据方差大,提取效果不稳定。

3.2 提取方法的选择

本科实验教学除了要讲透实验原理,训练学生实验技能,还要考虑实验成本、授课时长、操作难度、安全性和成功率等因素[12-15]。常规方法一是科研实验室的常用方法,但proteinase K使用量较大,试剂成本较高,人均超过3.5元,且提取时间略长,不适合本科生大班操作;常规方法二多用于法医对DNA的鉴定,样品需求量小,具有痕量检验的优势,但提取效果不稳定,且耗时较长,需要6个多小时,超出课程时长(表1),也不适用于本科教学;高效法是课题组改良自科研中使用的提取小鼠指甲DNA的方法[16],研磨后的果蝇组织经pH 12的NaOH溶液裂解,再高温加热加快裂解速度,加入Tris-HCl可中和碱性、溶解蛋白质杂质,离心后DNA即在上清液当中。高效法操作步骤少,提取时长在20 min以内,试剂成本极低,提取果蝇DNA效果理想,可重复性高,非常符合本科实验需求。

3.3 实验教学效果

YAP蛋白是果蝇经典Hippo信号通路的主要效应因子,具有促进细胞增殖,抑制细胞凋亡的作用,其过表达会造成组织器官增大。YAP基因通常会和GAL4/UAS表达系统联合使用,用于果蝇基因型与表型对应关系的实验教学。南开大学遗传学实验以含有YAP基因的果蝇为实验材料,使用高效法提取果蝇DNA扩增YAP基因,已在实验教学中成功进行3轮,500余名学生操作成功率达90%以上(图4)。

M:DNA Marker;1～9:学生使用高效法提取DNA扩增产物。图4 学生PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳Figure 4 Electrophoresis of PCR products of DNA by students

运用高效法提取DNA大大缩短了提取DNA的时间,降低耗材成本,提取效率高,为后续实验设计奠定了基础,推动课程建设,教学效果良好。