短乳杆菌SLB1000对Ⅱ型糖尿病大鼠的控糖作用

杜静婷，蔺 楠，施俊凤

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太原 030031）

继癌症和心血管疾病之后，糖尿病已成为第三大威胁人类健康的疾病。其中，Ⅱ型糖尿病占糖尿病总发病率的90%以上[1]。目前的治疗手段主要为服用二甲双胍、噻唑烷二酮类药物和胰岛素注射等[2]。研究表明，添加有益化合物和益生菌的功能性食品也可发挥重要作用，益生菌可以改善机体肠道菌群丰度、提高机体清除自由基能力、调节机体免疫因子，从而缓解糖尿病症状[3-5]。许女等[6]从山西老陈醋中筛选到可以降低血糖的植物乳杆菌173，通过调控与肝脏炎性反应、肠道黏蛋白等的相关基因表达来调控血糖。张宇等[2]研究表明，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）TD062 可以改善小鼠的Ⅱ型糖尿病症状，降低血糖水平和脏器指数，提高葡萄糖耐受性。Son 等[7]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KU15006可抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低血糖指数。

短乳杆菌通常从发酵食品、植物和人体肠道中分离而来。研究表明，短乳杆菌对人体多种疾病具有很好的预防和抑制作用[8]。Noureen 等[9]分离筛选出具有抗氧化作用的短乳杆菌MG000874，可提高D-gal 诱导小鼠体内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性；Riaz 等[10]研究发现，短乳杆菌MF179529 可降低单核细胞增生及李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）在肝脏、脾脏和肠道中的分化和定殖；Kariyawasam 等[11]研究表明，短乳杆菌KU200019 可以抑制大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）的活性。同样，某些短乳杆菌亚种也具有辅助降糖作用。Yakovlieva 等[12]发现，与单纯高糖饮食相比，在灌胃短乳杆菌15 d 后，大鼠的血糖上升更加缓慢；Abdelazez 等[13]通过研究发现，短乳杆菌KLDS 1.0727 和短乳杆菌KLDS 1.0373 可显著降低血糖过高对肝脏、胰腺及肾脏的损害。Li 等[14]发现，经短乳杆菌YM 1301 发酵后的黄精，其控制血糖的能力优于未发酵使用黄精。目前，国内益生菌株辅助降糖已成为一个新兴趋势，但国内有关短乳杆菌降糖的研究报道较少。本试验采用的短乳杆菌（Lactobacillus brevis）SLB1000 由作者分离自山西传统发酵酱萝卜，该菌株降糖效果较为明显。

肝脏及胰腺细胞受损导致胰岛素合成及分泌紊乱是导致Ⅱ型糖尿病发生的主要原因，同时氧化应激也可能导致胰岛细胞受损及外周胰岛素抵抗，从而产生高血糖症状[11,15]。因此，对患有Ⅱ型糖尿病SD大鼠实施不同剂量的短乳杆菌SLB1000灌胃术，通过研究其对大鼠体重、脏器指数、血糖、葡萄糖耐量及抗氧化水平的影响，探讨短乳杆菌SLB1000降低大鼠血糖的机制，为短乳杆菌在食品和保健品工业中的应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

短乳杆菌（Lactobacillus brevis）SLB1000，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），保藏登记号为CGMCC NO.20340，-80 ℃条件下保存备用。

SD 大鼠（实验动物许可证号为SCXK（京）2019-0010），鼠维持饲料和高脂高糖饲料（脂肪供能比为45%，碳水化合物供能比为35%，蛋白质供能比为20%），北京斯贝福生物技术有限公司；链脲佐菌素（Streptozocin，STZ），美国Sigma 公司；总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；MRS 培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；10%水合氯醛溶液，福州飞净生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

金稳型血糖测试系统及试纸，三诺生物传感股份有限公司；BX51 型微分干涉相差显微镜，OLYMPUS公司；DHP-9272型电热恒温培养器，上海科技有限公司；DW-HL340型超低温冷冻储存箱，中科美菱低温科技有限公司；ALLEGRAX-30R型离心机，贝克曼库尔特公司。

1.2 方法

1.2.1 试验菌种的制备

挑取保存于-80 ℃的短乳杆菌SLB1000，划线接种至MRS 固体培养基中活化，以3%接种量接种至MRS 液体培养基中，32 ℃振荡培养24 h，4 ℃条件下6 000 r/min 离心5 min，沉淀菌体，弃上清，重悬于pH为7.4 的0.9%生理盐水中，调整菌体浓度分别为1×108、1×109CFU/mL。

1.2.2 高血糖模型大鼠的建立及分组

健康SD大鼠，雄性，180～200 g，置于饲养环境下适应性喂养7 d，除正常组（N）10 只喂食普通维持饲料外，其他大鼠开始喂食高糖高脂饲料，18 d 后即试验第25 天腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kgmb，以空腹血糖＞7.0 mmol/L作为造模成功的判定标准[1]。

将造模成功的SD 大鼠分成4 组：Ⅱ型糖尿病模型组（M）、短乳杆菌SLB1000低剂量（1×108CFU/mL）组（EL）、短乳杆菌SLB1000 高剂量（1×1010CFU/mL）组（EH）、阳性对照（0.01 g/mL 二甲双胍）组（P），同时设置正常组（N），每组10只，按照10 mL/kgmb给予低剂量组和高剂量组SD大鼠灌胃相应剂量的短乳杆菌SLB1000，阳性对照组灌胃相同剂量的二甲双胍溶液，Ⅱ型糖尿病模型组和正常组灌胃相同剂量的生理盐水，自由饮水饮食，连续40 d。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 大鼠体重

自购买之日起，每5 d称量1次体重。

1.2.3.2 大鼠脏器指数

试验第75天禁食12 h后称量SD大鼠空腹体重，解剖SD大鼠取肝脏、肾脏，无菌水冲洗并擦干后称量脏器质量，按下式计算脏器指数。

式中：mK为杀检后大鼠的肾脏质量，g；mL为杀检后大鼠的肝脏质量，g；m为大鼠质量，kg。

1.2.3.3 大鼠血糖值及糖耐量

从开始喂食高脂高糖饲料之日起，每10 d 尾静脉针刺采血测空腹血糖[16]。灌胃结束后，禁食过夜，大鼠以2 g/kgmb灌胃葡萄糖溶液后分别于0、0.5、1.0、2.0 h测定血糖值，观察葡萄糖耐量（OGTT）。

1.2.3.4 血清及肝脏中抗氧化相关指标

动物血液及组织采集和处理[16]：试验结束后，SD 试验大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛溶液麻醉后，解剖SD 大鼠，于腹静脉针刺采血置于促凝血管中，4 ℃放置2 h 后，3 000 r/min 离心10 min得血清，于-80 ℃保存，进行血清中抗氧化相关指标的测定。

SD 大鼠血清及肝脏中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛含量、总抗氧化能力（T-AOC）均参照相应的试剂盒说明进行测定。

1.2.4 数据处理

采用SPSS 19.0 对数据进行差异显著性分析，假定方差齐性，采用LSD 模型对数据进行方差分析，试验数据均以¯x±s表示。

2 结果与分析

2.1 短乳杆菌SLB1000对大鼠体重的影响

由图1 可以看出，在最初的5～15 d 期间，对照组（N）体重增长均低于其他组。在试验的第25天时，腹腔注射STZ，10 d 后即试验第35 天造模成功的SD 大鼠达到56 只，满足试验要求。此试验期间，对照组（N）大鼠体重稳步增长，而其他组在试验35 d后表现出不同程度的体重下降，在45 d 时降至最低。在此期间大鼠排尿量和饮水量大大增加，体型明显消瘦，推断为糖尿病引起的体重下降。45 d 时，与模型组（M）相比，高剂量组（EH）和低剂量组（EL）体重分别高12.38%和9.62%。其中模型组（M）体重下降最大，阳性对照二甲双胍处理组（P）最接近正常体重。短乳杆菌高剂量组（EH）和低剂量组（EL）介于M组与P组之间，表明灌胃短乳杆菌SLB1000在一定程度上可以缓解Ⅱ型糖尿病引起的大鼠体重下降，且灌胃的剂量越大，对体重下降的抑制能力越强。

图1 短乳杆菌SLB1000对SD大鼠体重的影响Fig.1 Effect of L.brevis SLB1000 on body weight of SD rats

2.2 短乳杆菌SLB1000对大鼠空腹血糖的影响

由图2可以看出，在试验第35天时，SD大鼠的空腹血糖值明显升高，除正常组（N）外，其余4组空腹血糖值均达到15.0 mmol/L 以上，表明造模成功。结果表明，试验55 d（造模成功20 d）开始，阳性对照二甲双胍处理组（P）、短乳杆菌SLB1000的低剂量组（EL）和高剂量组（EH）大鼠的空腹血糖与模型组（M）相比均显著下降（P＜0.05）。其中，二甲双胍处理组（P）效果最好，其次是高浓度短乳杆菌处理组（EH），再次是低浓度短乳杆菌处理组（EL）。试验第55 天时，模型组（M）大鼠的空腹血糖值为19.52 mmol/L，而高剂量组（EH）和低剂量组（EL）的空腹血糖值分别为13.57 mmol/L和15.46 mmol/L，与模型组相比，分别下降了30.48%和20.80%。试验至75 d 时，除模型组（M）外，其他处理组大鼠的空腹血糖值接近正常组（N）血糖值（5.1 mmol/L），阳性对照组（P）、低剂量组（EL）、高剂量组（EH）分别为6.00、7.68、6.43 mmol/L，说明短乳杆菌SLB1000可有效调控SD大鼠机体内的空腹血糖水平。

图2 短乳杆菌SLB1000对SD大鼠空腹血糖的影响Fig.2 Effect of L.brevis SLB1000 on fasting blood glucose of SD rats

2.3 短乳杆菌SLB1000对大鼠口服糖耐量的影响

口服葡萄糖耐量及空腹血糖都是衡量机体血糖调节能力的重要指标[6,17]。灌胃2 g/kgmb葡萄糖后，分别测定SD 大鼠空腹血糖及0.5、1.0、2.0 h 的血糖，观察SD大鼠对葡萄糖的代谢能力。

由表1可知，模型组（M）的SD大鼠空腹血糖值显著高于其他组（P＜0.05），其中正常组（N）血糖最低，低剂量组（EL）空腹血糖值为7.22 mmol/L，略高于正常值，高剂量组（EH）空腹血糖值正常，为6.48 mmol/L，而模型组（M）则为18.94 mmol/L，说明短乳杆菌SLB1000 可有效降低SD 大鼠的空腹血糖值。2.0 h时，高剂量组（EH）、低剂量组（EL）的血糖值分别为20.23 mmol/L 和21.54 mmol/L，仍低于模型组（M），虽然高于正常临界值（16.7 mmol/L），但与模型组（M）的28.20 mmol/L 相比也显著下降。说明短乳杆菌SLB1000对血糖调节有一定益处，可作为降低血糖浓度的辅助治疗手段。

表1 SD大鼠口服葡萄糖耐量试验结果Table 1 Results of oral glucose tolerance test of SD rats单位：mmol/L

2.4 短乳杆菌SLB1000对大鼠脏器指数的影响

脏器指数为器官或组织的质量与体重的比值[18]。当脏器发生病变而导致水肿、肥大、充血时，器官或组织质量会发生变化，从而影响其脏器指数。5组SD大鼠肾脏指数和肝脏指数如图3所示。正常组（N）大鼠的肾脏指数为6.5 g/kg，而模型组（M）为10.5 g/kg，经过二甲双胍灌胃后，其数值降为8.9 g/kg（P组）；而短乳杆菌SLB1000 灌胃后，其高剂量组（EH）和低剂量组（EL）分别为8.4 g/kg和9.2 g/kg，与模型组（M）相比，分别降低了20.95%和12.38%。对于肝脏来说，其模型组（M）的肝脏指数为42.0 g/kg，二甲双胍处理组（P）下降了10.24%，而短乳杆菌低剂量组（EL）和高剂量组（EH）分别为35.4 g/kg 和30.4 g/kg，分别降低了15.71%和27.62%，其效果均好于二甲双胍灌胃处理。由此可见，短乳杆菌SLB1000 对肝、肾脏器病变有抑制缓解作用。

图3 短乳杆菌SLB1000对SD大鼠脏器指数的影响Fig.3 Effect of L.brevis SLB1000 on organ index of SD rats

2.5 短乳杆菌SLB1000对抗氧化活性的影响

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶是体内的重要酶类，能保护细胞不受过氧化物的损害[19]。大鼠血清抗氧化指标见表2。

表2 短乳杆菌SLB1000对SD大鼠血清抗氧化指标的影响Table 2 Effect of L.brevis SLB1000 on serum antioxidant index of SD rats

由表2 可以看出，与模型组（M）相比，两个剂量的短乳杆菌SLB1000 均可提高血清中SOD、GSH-Px和CAT活性，其中高剂量组（EH）较低剂量组（EL）效果更好。高剂量组（EH）大鼠血清中CAT 活性为69.16 U/mL，显著高于正常组（P＜0.05）。同时试验发现，随着短乳杆菌浓度的升高，大鼠血清中SOD、GSH-Px和CAT三种酶的活性也随之升高。

机体中不饱和脂肪酸被氧化后会生成MDA，因此，MDA 水平是衡量机体脂质过氧化水平的一个重要指标。与模型组（M）相比，高剂量组（EH）和低剂量组（EL）SD 大鼠血清中的MDA 含量大大降低，且降低效果明显优于二甲双胍处理组（P），二甲双胍处理组为模型组的68.87%，而高剂量组（EH）和低剂量组（EL）SD 大鼠血清中MDA 含量仅为模型组的4.07%和3.88%。本试验中，正常组（N）与模型组（M）的总抗氧化能力之间差异不显著，P、EL、EH 组均略高于M 组。综上得出，短乳杆菌SLB1000 可提高SD大鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性，并能降低机体中MDA含量，提高SD大鼠机体的抗氧化能力。

大鼠肝脏氧化应激水平指标如表3 所示，与模型组（M）相比，短乳杆菌SLB1000 可提高SD 大鼠肝脏中SOD、GSH-Px、CAT 活性，且与菌液剂量呈正相关。短乳杆菌的高剂量组（EH）可降低肝脏中MDA含量，且效果优于二甲双胍阳性对照组（P），而低剂量短乳杆菌SLB1000 对肝脏中MDA 含量无降低作用。模型组（M）肝脏内T-AOC 水平为87.55µmol/g，而短乳杆菌SLB1000 低剂量组（EL）和短乳杆菌SLB1000 高剂量组（EH）分别为149.43 µmol/g 和170.57 µmol/g，分别为模型组（M）的1.77 倍和1.95倍，推断短乳杆菌SLB1000 可提高SD 大鼠肝脏的抗氧化能力。

表3 短乳杆菌SLB1000对SD大鼠肝脏氧化应激水平的影响Table 3 Effect of L.brevis SLB1000 on liver oxidative stress levels of SD rats

3 结论

本试验筛选所得的短乳杆菌SLB1000 有一定的降糖效果，并能改善Ⅱ型糖尿病引起的机体器官损伤。在SD 大鼠体内，不同剂量组之间表现的效果存在差异，如脏器指数及SOD、GSH-Px、CAT活性，存在剂量依赖关系，高剂量短乳杆菌SLB1000可清除更多的自由基，从而使肝肾指数趋于正常。在连续灌胃40 d后可以明显降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖值，并能提高血糖耐受性。摄入短乳杆菌SLB1000 还能显著提高血清及肝脏中的SOD、GSH-Px 和CAT 酶类的活性，并降低MDA含量，同时提高肝脏中T-AOC水平。此外，菌株SLB1000还可以有效降低Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏和肾脏的脏器指数，缓解肌体内脏器肥大的现象。由此可见，短乳杆菌SLB1000不仅对Ⅱ型糖尿病SD大鼠具有调节血糖的功效，缓解糖尿病症状，而且可以诱导大鼠体内血清和肝脏的抗氧化反应，对由糖尿病引起的肾脏和肝脏的病变程度也有一定的保护作用。