黄河口滩涂翼内茧型藻的分离鉴定及盐度适应性分析*

肖同阳, 陈小凡, 刘 兴, 杨春富, 朱葆华, 潘克厚, 李 赟

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学), 山东 青岛 266003)

滩涂是海潮高潮位与低潮位之间的地带,由于潮汐的作用,滩涂具有海洋和陆地两个生态系统的特征[1]。咸淡水交汇的滩涂是海岸湿地生态食物链的起点,各种贝类、鸟类、鱼类、软体动物、节肢动物等栖息于此[2-3]。微型底栖生物是潮间带滩涂主要初级生产者,由底栖微藻、光合细菌和蓝细菌组成,通常以聚集在沉积物上层1 cm的底栖硅藻为主,生物量可达1 g·cm-2·d-1[4]。滩涂生境的物理及化学因子变化相当频繁,受降水、潮汐流、蒸发量增加或更多的淡水径流的影响,河口和近岸滩涂盐度会出现剧烈的变化,了解分布于滩涂的底栖生物对盐度变化的适应特点及适应机制是认识滩涂生物生态功能的重要基础。

翼内茧型藻属于硅藻门(Bacillariophyta)硅藻纲(Bacillariophyceae)双菱藻目(Surirellales)内茧藻科(Entomoneidaceae)翼内茧藻属(Entomoneis)的单细胞海洋硅藻。由于该藻种多不饱和脂肪酸特别是花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)含量丰富,目前常作为ARA生产的候选藻株[5]。有关翼内茧型藻的研究主要集中在营养[6-8]、光照[6,8]和温度[8]对其生长速率和代谢产物积累的影响,但关于翼内茧型藻对盐度的适应性研究仍相当有限。

黄河三角洲河口滩涂湿地(37°40′N—38°10′N,118°41′E—119°16′E)位于山东省东营市垦利区黄河入海口,地处渤海与莱州湾的交汇处,是典型的暖温带滨海湿地生态系统,景观类型多样且生物资源丰富[9-10]。本研究从黄河口滩涂泥样中分离出11株翼内茧型藻,在比较极端盐度对11株分离藻生长基础上,分析了不同盐度对其中3株藻株生长、光合活性及生理生化的影响,其目的是为了了解分离自滩涂的翼内茧型藻对盐度的适应性特点以及盐度对分离藻株生长、光合作用及主要生化组成的影响,为进一步探讨滩涂底栖微藻的耐盐机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 微藻分离鉴定

1.1.1 微藻的分离纯化 将从黄河口滩涂采取的泥样平铺于直径90 mm的培养皿中,厚度约0.5 cm,上面覆盖一层擦镜纸,擦镜纸上放置盖玻片,封口保湿,并将培养皿置于25 ℃恒温培养箱内,光暗循环为12 h∶12 h,光照强度为60 μmol·m-2·s-1,诱使底栖藻类因趋光而迁移至盖玻片。夹取放置48 h的盖玻片,解剖镜下初步观察盖玻片迁移底栖生物数量后,并立即移至盛有30 mL f/2液体培养基的三角瓶中,连续培养2周,培养基逐渐变成黄褐色。吸取80 μL培养液均匀涂布于f/2固体琼脂培养基上,10 d后平板上开始出现藻落,进一步培养3周后挑出单藻落,在盛有1 mL f/2液体培养基的48孔板中继续培养。待孔板中的藻液有明显颜色时,吸取藻液,显微镜下观察藻细胞形态特征及分离藻株纯度。纯化藻株接种在盛有60 mL f/2液体培养基的三角瓶中,进行扩大培养。培养条件为温度(23±1) ℃,光照强度60 μmol·m-2·s-1,光暗比12 h∶12 h。

光学显微镜下基于细胞形态进行分离藻的初步鉴定。经初步鉴定为与翼内茧型藻形态相似的藻株编号分别为HaB、HaD1、HaE、HaF、HaL、HaI、HsA、HsD1、HsD2、HsA2、HsD3共11株。

1.1.2 分离藻株的分子鉴定 分离藻株的分子鉴定基于18S rDNA和rbcL基因序列特征进行。藻株DNA使用E.Z.N.A.RHP Plant DNA Kit试剂盒提取。提取的DNA-20 ℃保存,用于PCR扩增。

本实验用于扩增微藻18S rDNA基因序列的通用引物为V8F(5’ATAACAGGTCTGTGATGCCCT3’)[11]和1510R(5’CCTTCYGCAGGTTCACCTAC3’)[12];用于扩增微藻rbcL基因序列的引物为rbcLF(5’ATGTCTCAATCTGTAWCAGAACGGACTC3’)和rbcLR(5’TAARAAWCKYTCTCTCCAACGCA3’)[13]。50 μL的PCR扩增反应体系中模板DNA 2 μL,一对引物各1 μL,2×TransStartRFastPfu PCR SuperMix 25 μL,ddH2O 21 μL。PCR反应在梯度PCR仪上完成,反应条件为94 ℃预变性5 min后,94 ℃变性40 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min共35个循环,随后72 ℃延伸10 min。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,胶回收纯化后送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序。

将测序获得的分离藻株18S rDNA和rbcL基因序列分别在NCBI(美国国家生物技术信息中心,National Center for Biotechnology Information)上进行BLAST同源性比对,下载相似性大于95%的序列信息用于构建系统发育树。本研究利用MEGA11.0软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树,通过自举(Bootstrap)数据集1 000次作为置信度检测。

1.2 盐度适应性分析

为了解分离藻株的盐度适应性,本试验首先比较了在盐度为5和80条件下11株分离藻株的生长情况,接种藻密度为1.5×105cell·mL-1。

随后对其中3株藻株进行了盐度梯度试验,梯度试验中盐度别为5、25、45、65和85。以天然海水(盐度30)为基础,用NaCl和无菌去离子水调节盐度。考虑到分离藻生长较慢,接种藻密度调整为3.0×105cell·mL。在9 d的盐度梯度实验期间,比较不同盐度条件下3株藻株的生长、光合能力及主要生化组分的变化。其中,生长比较采用每天测定藻细胞密度,计算并比较微藻的比生长速率。光合能力比较采用每天分析培养微藻的叶绿素荧光参数Fv/Fm和ETRm来评估。生化组分的分析则在培养实验结束时收集藻液,5 000g离心10 min,蒸馏水冲洗藻泥,重复离心3次,放入真空冷冻干燥机(Christ,德国)冻干成藻粉,分析藻粉中总脂和多糖含量。光合色素在培养至第9天时取藻液10 mL采用热乙醇法提取。具体分析方法如下:

1.2.1 微藻生长速率计算 每天定时取样,基于血球计数板法测定藻细胞生长密度。基于细胞密度的变化,计算比生长速率,比生长速率根据公式μ=(lnNt-lnN0)/t计算[14],式中,t为培养天数,Nt为第t天细胞密度值,N0为初始细胞密度值。

1.2.2 光合潜力分析 每天定时取2 mL藻液进行叶绿素荧光参数测量,测量前将微藻样品暗适应20 min,使用脉冲振幅调制荧光剂(Water-PAM fluorometer,Walz,Effeltrich, Germany)测定不同盐浓度下藻细胞叶绿素荧光参数Fv/Fm(PSII的最大光化学效率)和ETRm(电子传递速率最大值)的变化。

光列表参数设定为5、8、13、19、28、43、63、97、144、205、284、464、679 μmol/(m2·s),共12个梯度。Fv/Fm值可直接在仪器上读出,ETRm值则基于拟合方程ETRm=Ps×[α/(α+β)]×[β/(α+β)]β/α计算[15],式中:α为初始斜率;β为光抑制系数;Ps为最大潜在电子传递速率。

1.2.3 总脂含量分析 采用重量法测定总脂含量[16]。称取15 mg经真空冷冻干燥后的藻粉(m0),加入2 mL氯仿和1 mL甲醇,涡旋震荡15 min,摇床震荡12 h,8 000g离心10 min,收集上层提取液。下层沉淀重复以上操作。合并2次提取液,加入0.9%NaCl溶液,体积比为5∶1。将混合液漩涡5 min后静置15 min,分层后收集下层氯仿层,使用10 mL一次性注射器和0.22 μm有机滤器将氯仿层抽滤到新的离心管中(m1),55 ℃水浴蒸去溶剂氯仿,60 ℃烘干至恒重。称量所得油脂(m2),通过下列公式计算总脂含量:总脂=(m2-m1)/m0×100%。

1.2.4 光合色素含量分析 采用热乙醇法[17]测定色素含量。用GF/C玻璃纤维素膜(直径47 nm,孔径0.45 μm)收集10 mL藻液,弃滤液,将滤膜外包一层锡箔纸置冰箱-20 ℃条件下暗处理12 h,加入体积分数为95%、80 ℃预热的乙醇5 mL,置于80 ℃水浴锅中2 min,避光静置6 h进行萃取,以3 300g离心10 min,用分光光度计(UV-8000,Metash,上海,中国)测定上清液在480、510、630、664、710 nm处的光密度值(OD值),通过下列公式计算叶绿素[18]和类胡萝卜素[19]含量。叶绿素a=13.7×OD664-5.76×OD630;类胡萝卜素=(1 000×OD480-2.05×Chla)/245。

1.2.5 多糖含量分析 采用苯酚-硫酸法[20]测定可溶性多糖含量。准确称取5 mg经真空冷冻干燥后的藻粉,加入5 mL 0.05 mol/L硫酸,65 ℃抽提1 h,8 228g离心10 min,收集上清液,下层沉淀重复以上操作。随后,将1 mL多糖抽提液中加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸并涡旋30 s混匀,室温放置30 min,以1 mL 6%苯酚溶液与5 mL浓硫酸做参比,使用分光光度计(UV-8000,Metash,上海,中国)在 490 nm 处测量吸光值,通过葡萄糖标准曲线计算总多糖浓度。

1.3 数据处理

利用Origin 2018进行数据作图,Excel 2010和 SPSS 25.0软件对数据进行处理,采用Duncan’s法进行多重比较分析,P<0.05表示不同处理间具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 微藻分离与鉴定

光镜下分离的11株藻细胞均呈黄褐色(见图1),单个细胞形状相似,分别呈椭圆形或葫芦型。每个藻细胞含2个褐棕色色素体,细胞长在21～30 μm之间,中央收缩部位宽在5～10 μm之间,最宽部位宽在7～15 μm之间。基于形态特征,初步鉴定分离藻株可能属于翼内茧型藻属。

(A:HaB; B:HaF; C:HaI; D:HaD1;E:HaE; F:HaL; G:HsD2; H:HsD1; I:HsA2; J:HsD3; K:HsA。)

使用通用引物扩增11株分离藻细胞的18S rDNA和rbcL的部分序列,结果获得的18S rDNA和rbcL序列长度分别在700和610 bp左右。BLAST同源性搜索结果显示,有23株硅藻的18S rDNA基因序列和rbcL基因序列与11株分离藻的扩增序列的相似度达到95%以上。基于获得的23株硅藻的18S rDNA和rbcL序列与11个藻株的相应扩增序列,以小麦(Triticummonococcum)相应序列为外类群,构建系统进化树。

基于18S rDNA构建的NJ树如图2所示,本研究中11株分离藻与翼内茧型藻(Entomoneissp.)聚为一支。基于rbcL构建的NJ树如图3所示,分离藻株HaF、HaL、HaI、HsD1、HaE、HsD2、HsD3、HaB、HsA和HsA2仍然与Entomoneissp.完全聚为一支,获得了100%的支持率。而分离藻株HaD1与Entomoneisinfula的2个藻株聚为一支,获得了99%的支持率。结果表明,分离藻株HaD1属于Entomoneisinfula,而其余10株分离藻株属于翼内茧型藻属(Entomoneissp.)。

图2 基于18S rDNA序列构建11株分离藻株与相似种的系统发育树

图3 基于rbcL序列构建11株分离藻株与相似种的系统发育树

2.2 分离藻株的盐度适应性分析

2.2.1 分离藻株在极端盐度下的生长状况 11株分离藻株在极端盐度下的生长情况见表1。表1显示,11株翼内茧型藻在2个极端盐度条件下均能生长,如11株藻株,在盐度为5的低盐条件下,最大的藻细胞密度在1.66×105～13.00×105cell/mL之间,而在盐度为80的高盐条件下最大的藻细胞密度在2.80×105～8.00×105cell/mL之间。但同时也看到同一藻株对2个极端盐度的耐受性存在显著差别。如在低盐条件下,HaI、HaB和HaF藻株的比生长速率分别为0.432、0.428和0.305 d-1,但在高盐条件下,3个分离藻株的比生长速率则分别为0.151、0.335和0.309 d-1。在2个盐度条件下,HaF藻株的比生长速率基本一致,而HaI藻株的比生长速率则相差1.86倍。

表1 11株翼内茧型藻在低盐5和高盐80下比生长速率及最大藻细胞密度

进一步比较不同藻株对同一盐度的耐受性,结果显示不同藻株对同一盐度的耐受性存在显著差异(p<0.05)。在盐度5条件下,HaI藻株的比生长速率最大,为0.432 d-1,HaB藻株的比生长速率其次,为0.428 d-1,而HaL藻株的比生长速率最低,为0.021 d-1,HaI、HaB藻株与HaL藻株相比,比生长速率均相差20倍以上。而在盐度80条件下,HaB藻株的比生长速率最大,为0.335 d-1,HaF藻株的比生长速率其次,为0.309 d-1,HsA2藻株的比生长速率最低,为0.124 d-1,HaB、HaF藻株与HsA2藻株相比,比生长速率分别相差1.70和1.50倍。基于11株分离藻株在2个极端盐度的比生长速率,并考虑到藻株培养在f/2培养基上细胞密度的增长情况,筛选出低盐5培养条件下比生长速率最高的藻株HaI、高盐80培养条件下比生长速率次高的藻株HaF和两个极端培养条件下比生长速率均高的藻株HaB,这些藻株用于进一步比较盐度对翼内茧型藻光合能力及生化成分积累能力的影响。

2.2.2 3株筛选藻株生长的最适盐度比较 图4为筛选藻株HaF、HaI和HaB在不同盐度条件下的比生长速率。图4显示,当初始接种密度从1.5×105cell/mL增加至3.0×105cell/mL时,3株分离藻在盐度5时,比生长速率均分别从0.305、0.432和0.428 d-1降至0.121、0.183和0.165 d-1。当盐度增至25时,3个分离藻株的比生长速率均急剧升高,其中HaF藻株和HaI藻株比生长速率达到最大值,分别为0.411和0.233 d-1。随着盐度增加,HaF藻株和HaI藻株比生长速率均逐渐降低,当盐度为85时,其比生长速率分别只有0.159和0.092 d-1。而HaB藻株的比生长速率则在盐度为45时达到最大值,为0.322 d-1。说明高盐和低盐环境对3个分离藻株的生长均造成了显著的抑制效应,3株藻生长的最适盐度分别是25、25和45。

图4 盐度对HaF、HaI和HaB比生长速率的影响

进一步比较3个藻株在5个盐度条件下比生长速率的变化,结果显示,HaF藻株的比生长速率在0.121～0.411 d-1之间,HaI藻株比生长速率在0.092～0.233 d-1之间,HaB藻株的比生长速率在0.166～0.322 d-1之间。相对而言,在5个试验盐度下,HaB藻株比生长速率均比较高,说明该藻株对盐度的适应能力更强。

2.2.3 盐度对3株翼内茧型藻光合活性的影响 图5a—5f显示盐度对3株翼内茧型藻光合潜力的影响。单因子方差分析结果表明,整个培养周期中,不同盐度组对叶绿素荧光参数Fv/Fm和ETRm均有显著影响(p<0.05)。

图5 不同盐度对HaF藻株(a和b)HaI藻株(c和d)和HaB藻株(e和f)的Fv/Fm和ETRm值的影响

不同盐度下HaF藻株叶绿素荧光参数的变化如图5a和5b所示。从图5a中可以看到,培养的第2天,盐度5、45、65和85实验组Fv/Fm均达到最大值,分别为0.621、0.664、0.656和0.631,培养的第3天,盐度25实验组Fv/Fm达到最大值,为0.649。随后5个实验组均呈逐渐下降的趋势,培养末期Fv/Fm值与各实验组的峰值相比,分别下降了41.46%、12.47%、25.51%、20.14%和24.95%。从图5b中可以看到,培养的第2天,盐度5、65实验组的ETRm值均达到最大值,培养的第3天,盐度25、45、85实验组的ETRm值均达到最大值,随后5个实验组均呈逐渐下降的趋势。至培养末期,盐度5实验组的Fv/Fm和ETRm值均显著低于盐度25、盐度45、盐度65和盐度85组。

不同盐度下HaI藻株叶绿素荧光参数的变化如图5c和5d所示。从图5c中可以看到,5个实验组中,Fv/Fm最大值分别为0.678、0.667、0.663、0.628、0.598,低盐实验组Fv/Fm值大于高盐实验组。从图5d中可以看到在盐度5～85培养条件下,HaI藻株的ETRm数值也随着盐度升高而呈降低的趋势。至培养末期,盐度85实验组的Fv/Fm和ETRm值均显著低于盐度5、盐度25、盐度45和盐度65组。

不同盐度下HaB藻株叶绿素荧光参数的变化如图5e和5f所示。从图5e中可以看到5个实验组中Fv/Fm最大值分别为0.643、0.656、0.669、0.657和0.651,最高值出现在盐度45实验组;而从图5f中可以看到ETRm最高值出现在盐度25实验组,但不同实验组差别不大,反映出盐度对HaB藻株光合潜力的影响不大。

2.2.4 不同盐度对3株藻生化组分的影响 表2显示盐度对HaF、HaI和HaB藻株总脂、多糖、叶绿素和类胡萝卜素含量的影响。单因子方差分析结果表明,不同盐度组对3株分离藻生化组分含量均有显著影响(p<0.05)。

表2 不同盐度培养下HaF、HaI、HaB生化组分的变化

3个实验藻株总脂含量的最高值均出现在盐度5实验组,分别为68.231%、60.125%和63.324%。HaF和HaI藻株总脂含量的最低值均出现在盐度25实验组,分别为37.422%和45.168%,HaB藻株总脂含量的最低值出现在盐度45实验组,为36.523%。出现最低总脂含量的实验组盐度恰好是各分离藻株比生长速率最高的盐度。

但与总脂含量的变化相反,3个实验藻株多糖含量的最低值均出现在盐度5实验组,最高值均出现在盐度85实验组,3个藻株多糖含量的最高值分别比最低值高92.75%、32.74%和44.24%。

3个分离藻株各盐度实验组的光合色素含量最高值及最低值均与藻株比生长速率最高值和最低值的实验盐度相一致。如HaF和HaI藻株叶绿素a和类胡萝卜素含量的最大值均出现在盐度25实验组中,HaF藻株分别为3.731和1.472 μg/mL,HaI藻株分别为3.228和0.926 μg/mL,最低值均出现在盐度5和85极端盐度的实验组。2个藻株在2个极端盐度实验组的叶绿素a和类胡萝卜素含量均有显著差异,如盐度5实验组,HaF藻株的叶绿素a和类胡萝卜素分别为0.433和0.124 μg/mL,而HaI藻株的叶绿素a和类胡萝卜素分别为1.053和0.354 μg/mL;HaF藻株盐度25实验组的叶绿素a和类胡萝卜素含量分别比盐度5实验组高7.62倍和10.87倍。但是HaB藻株2种色素含量的最大值均出现在盐度45实验组,分别为3.507和1.372 μg/mL,最低值仅出现在5实验组,分别为0.878和0.291 μg/mL。盐度45实验组藻株的叶绿素a和类胡萝卜素含量分别比盐度5实验组的高2.99倍和3.72倍,比较而言,HaB藻株对高盐度有更强的耐受性。

3 讨论

18S rDNA、28S rDNA、ITS、rbcL、psbA以及COI是常用的用于鉴定硅藻物种的分子标记[21],多标记组合使用已经成为微藻分子生物学鉴定的常见方法,龚少华等[22]推荐使用rbcL-3P、5.8S rDNA和ITS2组合用于硅藻物种的种属鉴定。郭立亮等[23]以18S rDNA、ITS、UPA、COI和rbcL5个标记作为硅藻物种鉴定的分子生物学标签进行有效性评估,发现18S rDNA和rbcL对硅藻物种的区分度效果最好。本研究采取18S rDNA和rbcL两个分子标记相组合,将分离藻株扩增序列与其相似性最高的翼内茧型藻属的其他微藻种的相应序列进行比对,结果显示,分离藻株与翼内茧型藻属存在更近的亲缘关系。

已有研究显示,盐度影响着硅藻物种的生态位[24-25]。本研究分离的藻株采自黄河口滩涂,受季节性降雨以及上游淡水注入,加之滩涂水分蒸发,滩涂盐度处于频繁的变化之中。结合黄河口滩涂盐度变化范围[24],本研究初筛实验盐度为5和80,研究结果表明,11株分离藻株在2个极端盐度下生长状况差异显著,其中盐度5培养条件下,有8株分离藻的最大藻细胞密度和比生长速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,但在盐度80培养条件下,只有2株分离藻的最大藻细胞密度和比生长速率在7.0×105cell/mL和0.330 d-1以上,这说明本研究分离的多数藻株对低盐的适应能力普遍强于对高盐的适应能力。

关于翼内茧型藻对盐度的适应性研究,Yamamoto等[14]发现翼内茧型藻(Entomoneisjaponica)在2～30盐度范围内比生长速率从0.151 d-1上升到0.232 d-1,盐度30时,其比生长速率达到最高值,盐度50时比生长速率下降至0.074 d-1,几乎停止生长。本研究将3株翼内茧型藻分别培养在5～85实验盐度下,3株藻均可以生长,如在盐度5～45培养条件下,HaB藻株的比生长速率从0.166 d-1上升到0.323 d-1,而在盐度45～85培养条件下其比生长速率从0.323 d-1下降至0.219 d-1。相对而言,从黄河口滩涂上分离的翼内茧型藻藻株对盐度具有比较突出的适应性能力。

光合色素含量的高低与光合能力的强弱正相关,生长状况越好的藻体光合色素含量越高[26-27]。本研究结果显示HaF、HaI和HaB藻株光合色素(叶绿素a和类胡萝卜素)含量最高值时的实验盐度均与其生长的最适盐度完全一致,说明盐度对实验微藻光合能力的影响也与其对光合色素合成的影响有关。本研究叶绿素荧光参数ETRm和Fv/Fm的分析结果显示,HaF藻株在盐度为5的培养条件下Fv/Fm和ETRm值均显著降低,说明在低盐条件下HaF藻株的光合能力受到显著抑制。HaI藻株Fv/Fm和ETRm值均在盐度为5的培养条件下达到最大值,这一方面说明HaI藻株对低盐环境具有较高的耐受性,低盐胁迫对HaI藻株的光合能力具有一定的刺激作用。HaB藻株在5个不同实验组Fv/Fm和ETRm差别不大,这表明盐度变化对HaB藻株光合能力影响不大。 张奇等[28]发现,在盐度0～50条件下培养小球藻,盐度为0实验组中小球藻藻液的溶氧量最低,藻液中溶氧量降低不仅与小球藻光合作用降低有关,也与呼吸耗氧增强有关。Hagemann等[29]发现,低盐条件下呼吸作用产生的 ATP增多,用于在盐适应过程中为 P 型 ATP 酶或其他需要能量的过程提供能量。Billini 等[30]发现Na+/H+反转运蛋白在低盐培养基中可能是离子稳态所必需的。这些结果表明,盐度胁迫可增强呼吸作用,从而为相关耗能的生理活动提供必需的能量需求。本研究HaI藻株在盐度5实验组光合潜力最高,但藻细胞生长较慢,生物量积累有限,这可能与盐度为5时,HaI藻株呼吸作用增强,为平衡低盐胁迫而耗能过高有关。这些结果同时说明3株翼内茧型藻藻株对盐度胁迫的生理响应机制存在明显不同。

关于翼内茧型藻培养条件改变对生化组分积累的影响,Thierry等[7]发现翼内茧型藻(E.paludosa)在硅限制培养条件下细胞总脂含量最高,为59%,与对照组相比总脂含量提高了63%。本研究结果显示,HaF、HaI和HaB藻株3株翼内茧型藻均在盐度5的培养条件下总脂含量最高,分别为68.231%、60.125%和63.324%,而在优化的盐度下总脂含量最低,总脂含量最高值与最适盐度实验组相比,分别提高了82.33%、33.12%和3.38%。García等[31]也发现在低盐度时T.weissflogii的脂质含量最高。李嘉颖等[32]发现在盐度0～30培养范围内淡水栅藻细胞总脂与多糖含量变化趋势一致,随盐度的升高其含量逐渐降低,而本实验中3株分离藻株多糖与总脂含量的变化趋势相反,盐度为5时,总脂含量最高而多糖含量最低,可见不同藻种的生化合成能力对盐度变化的反应是不同的。推测低盐下积累总脂、高盐下合成多糖可能是黄河口滩涂底栖翼内茧型藻应对盐度波动的适应方式。

4 结语

本文利用平板涂布方法从黄河口滩涂泥样中分离出底栖微藻,经18S rDNA和rbcL两个分子标记组合鉴定其中11株为翼内茧型藻,随后主要研究了不同盐度培养条件对分离藻株生长速率、光合潜力和生化组分积累的影响。研究结果表明,河口滩涂上分离的翼内茧型藻藻株对盐度具有突出的适应性能力,实验盐度下都可以生长,但同时也看到不同藻株的最适生长盐度不同,光合潜力也存在显著变化,这表明分离藻株盐度适应性存在差异。不同盐度培养条件下,多糖含量均表现出随盐度增加而上升的现象,最大值出现在高盐实验组,而总脂含量最大值出现在低盐实验组,3株代表性藻株的色素含量均与比生长速率的变化趋势一致。这表明光合色素的高低与藻体生长状态呈正相关,同时低盐积累总脂,高盐分泌多糖可能是黄河口滩涂底栖硅藻应对盐度波动的良好策略。