高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定吸附无细胞百（三组分）白破灭活脊髓灰质炎和b 型流感嗜血杆菌（结合）联合疫苗的多糖含量

杨柏峰，吕溪琳，吴丽洁，赵明，李世慧

目的 采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定吸附无细胞百（三组分）白破灭活脊髓灰质炎和 b 型流感嗜血杆菌（结合）联合疫苗（以下简称 DTacP-sIPV-Hib）中多糖含量，并对方法进行验证。

方法 在 1 ml 样品中加入 0.02 g 柠檬酸钠，振荡混匀后，置于 37 ℃ 保温 24 h，4000 × g 离心 5 min 收集上清液，稀释后加入 6 mol/L 盐酸，100 ℃ 下加热 2 h，冰浴 10 min后加入 0.8 ml 氢氧化钠（1 mol/L）溶液用于终止酸水解。采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法根据检测信号峰面积计算对应水解荚膜多糖（PRP）含量，通过 PRP 占多糖含量干重的 41.3% 计算出总的多糖含量。

结果 核糖醇参考品浓度在 0.1 ～ 1.5 μg/ml 范围内标准曲线 r2 ＞ 0.99，检测下限可达 10 ng/ml。核糖醇加标回收率均在 95% ～ 105%；对高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法检测多糖的重复性和中间精密度进行验证，相对标准偏差（RSD）均小于 5%，方法专属性和耐用性良好。

结论 使用柠檬酸钠作为解吸附剂，与高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法相结合可用于 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖的含量检测，为产品的质量控制和稳定性研究提供参考。

b 型流感嗜血杆菌（Hib）在五岁以下儿童中可引起严重的侵袭性感染，包括脑膜炎、肺炎、败血症和心包炎[1]。Hib 疫苗显著降低了与 Hib 疾病相关的儿童发病率和死亡率[2]。随着我国免疫规划的不断推进，儿童接种疫苗的种类和频率不断增加。为了简化免疫程序，提高疫苗接种的及时性，降低扩大免疫计划的实施成本，并为儿童提供更好的保护，开发和推广能够同时预防多种疾病的联合疫苗已成为新疫苗开发的一种趋势。联合疫苗的使用在简化免疫程序、提高及时接种率和接种者的依从性以及降低疫苗管理成本方面具有巨大优势，这是儿童疫苗计划的目标[3]。总之，联合疫苗的开发和应用已成为政府、制造商和研发机构关注的问题和优先事项。

Hib 多糖蛋白结合物可以与不同的疫苗抗原结合，如白喉（D）、破伤风（T）、无细胞百日咳、乙型肝炎（Hep B）和脊髓灰质炎病毒（IPV）[4-5]，其与这些抗原中的任何一种以及佐剂、防腐剂和其他赋形剂的结合都可能会干扰对 Hib 疫苗关键质量属性的分析，如总糖或游离（未结合）多糖含量[6-7]。鉴于这类疫苗的复杂性，开发适宜的方法来跟踪这些成分在联合疫苗复杂基质中的含量变得越来越重要。疫苗是供健康人类使用的产品，因此需要对其进行严格的表征和分析，以确保最终产品的质量和批间一致性。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）是一种常用的碳水化合物分析技术[8-9]，用于监测多糖和多糖蛋白结合疫苗的质量和批间一致性，包括 Hib[7]、肺炎链球菌[10]、脑膜炎奈瑟菌[11]、B 组链球菌[12]，沙门氏菌多糖[13]以及相应的结合疫苗。该方法具有灵敏度高、分离效果好、重现性好、不需要样品衍生化等优点，已逐渐成为碳水化合物分析的首选方法之一[8]。

Hib 疫苗以 5-核糖醇-(1-1)-β-d-核糖-3-磷酸重复序列制成的荚膜多糖（聚核糖基核糖醇磷酸，PRP）作为主要抗原，在 DTacP-sIPV-Hib 疫苗中，PRP 含量是评价疫苗有效性的关键指标之一。但联合疫苗存在多种成分，这使得方法的开发和验证变得复杂[14-15]。1994 年，美国食品药品监督管理局疫苗研究与评估中心首次发表了使用 HPAEC-PAD方法检测 Hib 疫苗多糖含量（结合和未结合）[7]。该方法使用氢氧化钠水解产生 Hib 亚基，将其在 CarboPac PA1 柱上用 25 mmol/L NaOH 和150 mmol/L 乙酸钠的流动相分离，并将葡萄糖-1-磷酸作为内标。默克公司的研究人员对该方法进行了一些修改，将分析柱改为 CarboPac PA10，并添加超速离心[16]。上述实验结果表明，HPAEC-PAD法能稳定地检测 Hib 结合疫苗中多糖的含量。然而，DTacP-sIPV-Hib 尚未纳入《中国药典》，对于联苗中 Hib 含量的检测缺乏相应的指导方法。使用 Hib 单苗中用于测定 Hib 多糖含量的地衣酚法检测联合疫苗中的 Hib 多糖含量时，测定值与理论值有很大差异。因此，寻找一种在不受其他抗原干扰的情况下检测联合疫苗中各成分含量的合适方法已成为一个热门话题。本研究将解吸附剂与离子色谱法结合用于 DTacP-sIPV-Hib 疫苗成品中Hib 多糖含量的检测，并进行方法学验证。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗及参考品 DTacP-sIPV-Hib 样品购自北京生物制品研究所有限责任公司，批号202111S04、202111S05、202111S06；Hib-TT 偶联疫苗原液购自兰州生物制品研究所有限责任公司，批号 B-20210801；核糖醇参考品购自美国 Sigma公司，批号：BCCC2962，纯度 ≥ 99%。

1.1.2 试剂 50% 氢氧化钠溶液（色谱纯）购自美国 Fisher 化学公司；盐酸溶液购自北京化工厂；柠檬酸三钠（纯度 ≥ 99%）购自美国 Alfa Aesar公司。通过 Milli-Q 系统（Millipore，USA）制备超纯水。

1.1.3 色谱柱及仪器 色谱柱 DionexCarboPac MA-1（250 mm × 4 mm）、色谱柱 DionexCarboPac MA-1 保护柱（50 mm × 4 mm）和 ICS-5000 离子色谱仪均为美国戴安公司产品；变色龙 6.8 色谱工作站和 Sorvall ST4R Plus 离心机为美国 Thermo公司产品；15 ml 超滤离心管（10 kD）、精密分析天平（BS224S）和超纯水仪（arium®pro）购自美国 Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品和定量参考品制备

1.2.1.1 含铝佐剂疫苗样品预处理 吸取 1 ml DTacP-sIPV-Hib，加入 0.02 g 柠檬酸钠，振荡混匀后，置于 37 ℃ 保温 24 h，以 4000 ×g离心 5 min收集上清液，稀释适宜倍数至标准曲线范围，作为待检样品。

1.2.1.2 核糖醇参考品制备 先配制 300 μg/ml的核糖醇参考品储备液，然后用超纯水稀释核糖醇储备液，得到核糖醇参考品工作液。标准曲线包含六个点，范围为 0.1 ～ 1.5 μg/ml。

1.2.1.3 盐酸水解 将所有稀释好的待检样品、浓度范围在 0.1 ～ 1.5 μg/ml 的核糖醇参考品工作液和空白对照（超纯水）转移至 2 ml 玻璃试管中，加入 0.1 ml 盐酸（6 mol/L），100 ℃ 下加热 2 h，冰浴 10 min，加入 0.8 ml 氢氧化钠溶液（1 mol/L）终止水解。所有样品均通过 0.22 μm 膜过滤收集，用于 HPAEC-PAD 分析。

1.2.1.4 离子色谱检测 流动相：580 mmol/L 氢氧化钠溶液；流速：0.3 ml/min；安培检测器，检测器温度 30 ℃；柱温：30 ℃；进样体积：25 μl，进样 2 次；洗脱方式：等度洗脱，使用具有金工作电极和 Ag/AgCl 参比电极的脉冲安培模式监测流出物。用流动相平衡色谱系统，待基线稳定后，将参考品及待检样品分别注入色谱柱。使用Chromeleon 6.8 软件（Dionex）对所得色谱数据进行整合和处理。

1.2.2 方法验证

1.2.2.1 专属性 确认 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖含量检定方法在规定条件下，所测目标物为Hib 而非其他物质，证明该方法对 Hib 的检测具有专属性。取“1.2.1.3”溶液，按“1.2.1.4”所述条件上机检测，记录色谱峰保留时间。

1.2.2.2 线性与范围 每个核糖醇参考品浓度（0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 和 1.5 μg/ml）按“1.2.1.4”所述条件重复测定 6 次，以峰面积（x）为横坐标，核糖醇参考品浓度（y）为纵坐标，绘制标准曲线，统计相关系数、各浓度平均值、标准偏差（standard deviation，SD）及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.2.3 检测限（LOD） 将 0.1 μg/ml 核糖醇参考品稀释至约 5 ng/ml，按“1.2.1.4”色谱条件检测多糖含量，以信噪比（S/N）3:1 为检测限。

1.2.2.4 准确度 取按“1.2.1.1”处理后的样品溶液（批号：202111S04），稀释至 0.1929 μg/ml，取 1 ml 分别加入 1 ml 的高（1.2 μg/ml）、中（0.6 μg/ml）、低（0.2 μg/ml）三个浓度的核糖醇参考品，按“1.2.1.3”进行供试品水解，按“1.2.1.4”色谱条件进行检测，计算供试品多糖含量的平均加标回收率（%）、均值及 RSD。

回收率（%）=（加标样品检测值 - 供试品加入值）/核糖醇理论加值 × 100%

1.2.2.5 精密度

⑴重复性：按“1.2.1.4”色谱条件重复检测DTacP-sIPV-Hib（批号：202111S04）6 次，统计峰面积、多糖含量和塔板数的 RSD。

⑵中间精密度：同一操作人员、不同操作人员检测高（1.4 μg/ml）、中（0.8 μg/ml）、低（0.2 μg/ml）质量浓度的核糖醇参考品，每个浓度平行检测3 次，统计各浓度测定的平均值、标准差 SD 及RSD。

1.2.2.6 耐用性 测试在不同流动相浓度、柱温和流速下，实验的耐受程度。每次实验保证其他条件不变情况下，确定为单一变量（流动相浓度从580 mmol/L 改变为 450 mmol/L、柱温从 30 ℃ 改变为 32 ℃、流速从 0.3 ml/min 改变为 0.4 ml/min），按“1.2.1.4”所述条件上机检测，分别记录不同条件下三批五联苗中 Hib 多糖含量，考察方法的耐用性。

1.2.2.7 方法初步应用 采用建立的方法测定三批 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib 多糖的总含量。按照以下公式计算多糖含量：

多糖含量（μg/ml）=（稀释倍数 × 样品中核糖醇含量）/0.413

1.3 统计学处理

采用 Excel 2017 软件计算平均值、SD 及RSD，并进行线性拟合，计算线性关系及相关系数（r2）。

2 结果

2.1 色谱柱的选择

PRP 的 HPAEC-PAD 分析的早期研究使用CarboPac PA1 和 CarboPac PA10 柱[7,15,17]。我们参考制造商的推荐及相关文献[18]，最终选取 MA1 色谱柱作为本次研究的色谱柱。

2.2 专属性

采用 HPAEC-PAD 和 MA1 柱对不同醇类物质进行分离研究。核糖醇参考品（图 1A）、Hib-TT结合疫苗原液（图 1B）和 DTacP-sIPV-Hib（图 1C）在相应位置均具有明显的色谱峰（保留时间约21.5 min），而空白对照品（图 1D）和甘油（图 1E）在相应保留时间均无相应的色谱峰，表明该方法具有良好的专属性。

图1 专属性色谱图（A：核糖醇参考品；B：Hib-TT 结合疫苗原液；C：DTacP-sIPV-Hib；D：空白；E：甘油）Figure 1 Chromatogram for verification of specificity (A: Ribitol reference; B: Hib-TT conjugate vaccine stock solution;C: DTacP-sIPV-Hib; D: Blank; E: Glycerol)

2.3 线性

通过信噪比（N/S ≥ 3）测定该方法的检出限为 10 ng/ml，表明该方法灵敏度高。对核糖醇参考品标准曲线进行 6 次测定，测定结果见表 1。6 次结果的线性相关系数r2均大于 0.99，综合斜率和截距，证明该方法的线性关系良好。不同浓度的参考品的峰值时间保持不变（从 21.534 ～21.634 min），如图 2 所示。

图2 核糖醇参考品标准曲线Figure 2 Standard curve detection of ribitol reference substance

表1 核糖醇参考品测定线性数据结果Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient

2.4 准确度

在 DTacP-sIPV-Hib（批号 202111S04）中加入高、中、低三个浓度参考品后的核糖回收率分别为100.43%、101.33% 和 100.44%，均在 95% ～ 105%之间，见表 2。表明该方法对 Hib 检测无干扰，方法准确度良好。

表2 准确度验证结果Table 2 Verification for accuracy

2.5 精密度

同一操作人员连续检测 6 次同一批五联苗样品，Hib 多糖含量的 RSD（n = 6）为 1.45%，表明重复性良好。结果见表 3。

表3 重复性验证结果Table 3 Verification for repeatability

不同操作人员对相同核糖醇参考品低（0.2 μg/ml）、中（0.8 μg/ml）、高（1.4 μg/ml）质量浓度 3 次检测的相对标准偏差 RSD 分别为2.17%、2.52% 和 1.74%，见表 4。满足人员间 RSD＜ 15% 的要求，说明中间精密度良好。

表4 中间精密度验证结果Table 4 Verification for intermediate precision

2.6 耐用性

改变单一因素（柱温、流速或洗脱液浓度）后得到的核糖醇参考品标准曲线具有良好的线性（r2＞ 0.99）。改变柱温（30 → 32 ℃）后，各浓度的峰面积变化不大。虽然在改变流速后，每个浓度下的参比物的峰面积变得小于对照品的峰面积，并且在改变洗脱液浓度（580 → 450 mmol/L）后，各个浓度下的参考产物的峰面积变大，但是各条件下线性方程相关系数均大于 0.99，结果如表 5 所示。改变单一条件后，DTacP-sIPV-Hib 中 Hib 含量的RSD 均小于 5%，如表 6 所示。以上结果表明，在改变流速、柱温或洗脱液浓度后，该方法具有良好的耐用性。

表5 耐用性验证Table 5 The results of durability verification

表6 不同条件下联合疫苗中 Hib 含量测定结果Table 6 Test results of polysaccharide content of test sample under different conditions

2.7 初步应用

利用建立的 HPAEC-PAD 法检测 3 批DTacP-sIPV-Hib，多糖含量分别为 19.114、21.005和 18.511 μg/ml。为了更好地对 DTacP-sIPV-Hib中 Hib 含量的检测方法进行验证，用该方法对三批疫苗各进行了 19 次检测，统计分析了 19 次结果的 95% 置信区间（CI）为 16.58 ～ 21.77 μg/ml，结果表明该方法适用于 DTacP-sIPV-Hib 中 Hib多糖含量测定，精密度良好，具有很好的方法重复性，见表 7。

表7 DTacP-sIPV-Hib 联合疫苗中 Hib 多糖含量检测结果Table 7 Detection results of Hib polysaccharide content in DTacP-sIPV-Hib combined vaccine

3 讨论

由于 Hib 疫苗可以有效减少 Hib 侵袭性感染[19]，世界卫生组织（WHO）推荐使用 Hib 疫苗来减少 Hib 相关疾病的感染和发病率。截至 2020年，全世界 194 个世界卫生组织成员国（地区）中有 193 个已将 Hib 疫苗纳入其免疫规划。根据疫苗接种史，在 18 个月以下儿童中多糖-蛋白质结合疫苗比多糖疫苗更有效[20]。

传统的 Hib 多糖含量检测方法包括化学法（地衣酚）和 ELISA 法，目前最常用的方法是地衣酚法，也是《中国药典》规定的标准方法。但地衣酚法会受到乳糖或蔗糖等常用保护剂的干扰，而ELISA 方法受不同批次 Hib 抗体的影响较大。HPAEC-PAD 离子色谱法不受上述条件的干扰，具有更高的灵敏度和准确度，因此可用于测量低浓度PRP 多糖样品，如游离多糖含量，离子色谱法的灵敏度是地衣酚法的 30 倍[7]。迄今为止，英国国家生物制品控制研究所（NIBSC）已采用 HPAEC-PAD法作为测定 Hib 和脑膜炎球菌疫苗中多糖含量的标准方法[8]。

本研究中，采用 HPAEC-PAD 法来检测DTacP-sIPV-Hib 中总的多糖含量。样品中首先加入柠檬酸钠从氢氧化铝佐剂中解吸所有 PRP，然后通过 4000 ×g离心 5 min 来收集上清液，再加入高浓度盐酸（6 mol/L）将样品水解以使 PRP 制备成核糖醇单体。使用 580 mmol/L 氢氧化钠作为流动相，等度洗脱模式提高了测定效率。通过 CarboPac MA1 色谱柱分离核糖醇单体，最终通过电流检测器检测。用该方法测定了三批 DTacP-sIPV-Hib 中Hib 的含量，结果与理论值无显著差异，回收率大于 95%，这表明添加柠檬酸钠减少了氢氧化铝佐剂对 Hib 的吸附，并且使用高浓度的酸可以将多糖完全水解成 PRP 单元。联合疫苗中游离多糖和载体蛋白结合的多糖含量也是评价含多糖类疫苗的关键指标，本研究的方法不太适用于以上多糖含量的检测，目前正在积极开发检测游离多糖和载体蛋白结合的多糖含量的检测方法。

总之，本研究建立的酸水解联合 HPAEC-PAD法检测联合疫苗中 Hib 总多糖含量具有良好的特异性、精密性、稳定性和准确性。该方法不需要进行样品衍生，可以批量检测含铝佐剂中 Hib 多糖的含量。同时，为检测其他多糖蛋白偶联物或联合疫苗中的多糖提供了思路。