基于网络药理学及分子对接技术探讨刺梨干预脓毒症的作用

苗得庆，周 樊，范志梁，顾春松*

脓毒症是机体因细菌、病毒等病原微生物感染后出现的全身炎性反应综合征.该病早期识别和诊断困难，其中因诊治不当导致的感染性休克死亡率高达40%，严重危害人们健康［1］.刺梨为蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的果实（RosaroxburghiiTratt），首次记载于《本草纲目拾遗》，是贵州常用的民族中药材，其味甘、酸，是滋补健身的佳果.现代药理研究表明，刺梨具有降血脂、抗肿瘤、抗氧化应激等作用［2］.刺梨资源丰富、价格低廉、毒副作用小、不易产生耐药性，是治疗脓毒症的潜在药物.但是目前尚缺少刺梨治疗脓毒症的相关药理作用及物质基础的具体研究，本文利用网络药理学研究方法，筛选刺梨化学活性物质并推测其干预脓毒症的作用靶点、机制，为后期该药物临床应用提供科学理论依据.

1 材料与方法

1.1 刺梨相关成分及靶点筛选

通过查阅刺梨相关文献对其所含化学成分进行总结，并使用chemdraw 软件绘制各化合物结构.将绘制的各化合物结构输入SwissADME数据库，并规定选取化合物标准：GIabsortion为“High”，说明该成分口服生物利用度好，易吸收；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 五 种类药性检测中结果有不少于2 个“Yes”.

根据文献查阅结果，若化合物药理作用与脓毒症相关性较高，仍保留并纳入得到最终潜在化合物.再利用基于药效团匹配法的PharmMapper 数据库获取不同潜在化合物的核心作用靶点，选NF（Normalized Fit Score）≥0.9的靶点蛋白，结合相关文献报道，综合得到活性化合物的核心作用靶点.

1.2 疾病靶点筛选

为保证目标数据正确、全面，以“sepsis”“sepsis shock”等相关脓毒症名词为关键搜索词，搜索Gene Cards 数据库、DRUG BANK 数据库、OMIM 数据库、Therapeutic Target Database数据库以获得脓毒症疾病的核心靶点.其中DRUG BANK 数据库由临床试药数据构建，Gene Cards、OMIM、Therapeutic Target Database数据库基于文献数据，故本实验采用不同数据库进行疾病靶点收集可获得更加全面的靶点信息.将所收集靶点信息去重合并，使用UniProt 蛋白质数据库将疾病靶点与药物化学成分的潜在靶点统一规范为Gene Symbol，其后将两者进行映射，以获得刺梨潜在干预脓毒症的靶点.

1.3 刺梨成分-脓毒症靶点

将所获的交集靶点上传至STRING 11.5 数据库，并将Organisms 选择为“Homo sapiens”，设置置信度为0.40，随后进行PPI 网络关系分析，并将所得结果导入CytoScape 3.7.2 软件.利用该软件分析蛋白质相互作用关系，得到相关蛋白质具有的潜在功能.

1.4 刺梨成分与脓毒症靶点GO 功能富集和KEGG 通路富集

利用Metascape 数据库进行核心靶点的生物信息富集分析，包括GO 分析的生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC）和KEGG通路.

1.5 成分-靶点-通路网络图的构建

综合“1.4”所得生物信息富集分析结果与“1.2”所得药物疾病交集靶点，将其导入到CytoScape3.7.2 软件中构建：药物成分−靶点−通路网络图.利用CytoScape 3.7.2 软件得到刺梨潜在化学成分及靶点的拓扑分析结果，包括介度（Betweenness）、连接度（Degree），并根据网络拓扑分析结果得到核心靶点及干预脓毒症的主要活性成分.

1.6 分子对接评估

选择分析得到刺梨成分−脓毒症靶点网络图中度值排名前6 的靶点.通过RCSB 数据库下载其pdb 格式，利用Open Babel 软件将核心化合物转换为pdb 格式.采用pymol 软件对蛋白进行除水、去配体、加氢等处理并储存为pdbqt 格式，对潜在化合物进行减少能量并赋予配体原子类型等处理并储存为pdbqt 格式，利用Schrödinger 软件进行分子对接处理，以对接得分作为判断二者结合活性的参考.

2 结果

2.1 刺梨主要活性成分靶点预测结果

综合相关文献共获得刺梨相关的100 个化学结构，其主要成分为黄酮类、多糖类和有机酸类，还包括萜类等成分.通过SwissADME筛选出57 种活性成分，其中活性最强的10 个活性成分结构见表1.利用PharmMapper 预测并选择NF≥0.9 的靶点，去除所有重复基因后共计132 个预测靶点.

表1 刺梨活性最高的10 种成分

2.2 刺梨干预脓毒症相关靶点获取

在Gene cards 数据库中得到脓毒症疾病相关靶点2 974 个，选取Score≥0.55 的结果并结合Therapeutic Target Database、DRUG BANK、OMIM 数据库进行补充，去重合并收集到1 497个相关疾病靶点.将刺梨有效成分的132 个靶点与1 497 个脓毒症相关靶点取交集，获得30个交集靶点，并将结果绘制成VENN 图（图1）.

图1 药物-疾病靶点VENN 图

2.3 PPI 网络构建

将30 个交集靶点上传至STRING11.5 数据库进行PPI 分析.并利用CytoScape 3.7.2 软件构建PPI 网络（图2），进一步分析网络信息，推测AKT、SRC、MMP9 等为核心靶点.

图2 刺梨-脓毒症靶点PPI 网络

2.4 GO 功能富集和KEGG 通路富集

运用Metascape 数据库对潜在核心靶点进行生物信息富集分析（图3）.图3（a）表明刺梨干预脓毒症相关核心生物过程为：调节脂质结合（lipid binding）、调节激酶活性（kinase activity）、调节磷酸转移酶活性（phosphotrans⁃ferase activity）.图3（b）为KEGG 通路富集分析结果中刺梨干预脓毒症排名前20 的信号通路.

图3 刺梨主要成分潜在靶点的富集分析

2.5 刺梨成分-靶点-通路网络的构建

运用CytoScape 3.7.2 构建“刺梨成分−靶点−通路”网络图，并分析得到刺梨干预脓毒症疾病靶点网络拓扑信息数据，进而分析得到核心化学成分及作用靶点.如图4 所示，此网络由167 个节点和361 条边构成，橙色节点表示刺梨潜在靶点，红色节点表示刺梨中的潜在信号通路，蓝色节点表示刺梨活性成分.

图4 刺梨干预脓毒症成分-靶点-通路图

通过CytoScape 对网络进行分析发现，刺梨每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了刺梨内含的多种成分可能通过多靶点干预脓毒症.其中CL49（槲皮素）连接度为68，介度为0.519 333 77，紧密度为0.521 126 76，预测CL49 为刺梨干预脓毒症的主要成分，其次为CL46（鞣花酸），连接度为41，介度为0.260 542 11，紧密度为0.440 476 19（表2）.AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 靶点基因的网络节点度排位靠前，连接度分别为21、19、12、12，预测Phospholipase D signaling pathway 为刺梨干预脓毒症的核心靶点（表3）.

表2 刺梨主要活性成分网络节点特征参数

表3 刺梨主要活性成分靶点网络节点特征参数

由表4 可知，不同通路是通过共有靶点相互连接形成，表明刺梨可能通过多条通路协同发力起到干预脓毒症的作用.

表4 刺梨干预脓毒症靶点通路富集结果

2.6 刺梨分子对接筛选

将刺梨中排名前十名的化合物与AKT1、APOE、ERBB2、ESR1、MMP9、SRC 6 个核心蛋白进行分子对接，得到60 组化合物−蛋白对接结果.其中所有对接得分均<−4，对接得分最高的为ESR1−CL76，分值−10.04，表明刺梨核心化合物与核心蛋白靶点有较强的结合活性.本文对接结果为进一步进行刺梨相关实验提供理论支撑，对接结果见图5，核心化合物分子对接模式见图6.

图5 分子对接结果

图6 刺梨部分核心化合物分子对接模式

3 讨论

中医原理中并没有脓毒症相关概述，根据《伤寒论》和《温病学》的有关中医理论，将脓毒症归属于“热病”“温病”等范畴，多是从“毒瘀虚”阐述脓毒症的病因病机，治疗上多用清热解毒类药物［3−4］.刺梨是贵州省代表民族药物，有健脾养胃、补肾壮阳等功效，现代药理研究发现其还有提高免疫力、延缓衰老、保护血管等作用.本研究利用网络药理学方法，构建成分−靶点−信号通路网络，通过分析相关网络要素（节点、度值等），探讨了刺梨干预脓毒症的主要成分.

3.1 成分分析

通过对刺梨成分的研究发现，刺梨主要活性成分以槲皮素、山奈酚、木犀草素、儿茶素等黄酮类成分为主，而黄酮类化合物也是刺梨果实中含量最高、活性最强的成分［5］.有研究发现，槲皮素可通过PI3K 途径减轻脓毒症小鼠心肌组织炎性及氧化应激反应，进而达到缓解心肌损伤的作用［6］.此外，槲皮素还对脓毒症肺损伤的大鼠有保护作用，其机制与减少NF−κB p65 蛋白表达有关［7］.鞣花酸和木犀草素在网络拓扑分析中分别排名2、3位，其中鞣花酸可通过Nrf2/HO−1 途径对脓毒症心功能不全的小鼠有显著保护作用［8］，而木犀草素可通过ROS、NF−κB、Caspase 等通路发挥对脓毒症的调控作用［9−11］.儿茶素和没食子酸亦为刺梨的主要活性物质，前者单独使用可抑制NLRP3 炎症小体活化，二者联合使用有较强的抗菌活性，具有潜在的脓毒症干预作用［12］.

分子对接结果显示，刺梨排名前十的化合物均与主要蛋白靶点有较强的结合活性，且CL76（儿茶素）化合物与6 个蛋白的结合能均<−5，且平均值最低，表明该成分可能是刺梨干预脓毒症作用的关键成分.

3.2 潜在靶点分析

分析结果显示，AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9、ERBB2、MMP2 等靶点排名靠前，推测可能是刺梨干预脓毒症的关键靶点.

丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）是关键致癌蛋白，可介导细胞存活、增殖、凋亡等过程［13］.AKT1 作为AKT 家族的重要成员，是其中最活跃的增殖和生存途径蛋白，当AKT 被磷酸化激活后，其下GSK3β 蛋白活性受到抑制的同时，β−catenin 的磷酸化过程被阻断而不能降解，以至于β−catenin 在细胞内大量聚集并进入细胞核，加速细胞凋亡及炎性激活［14］.因此抑制AKT1 激活有助于增加组织抗炎、抗凋亡等作用，进而减轻脑水肿、保护血脑屏障并减轻脑损伤［15］.PI3K 是经典存活通路蛋白，位于AKT 上游，与AKT 共同组成信号通路调节细胞的自噬发生，这与KEGG 分析结果一致，说明PI3K 和AKT 靶点在刺激干预脓毒症过程中起关键作用［16］.SRC 是酪氨酸激酶价值的重要蛋白酶，在调节免疫细胞募集和机体防御中具有重要作用，其可参与ROCK、NF−κB 等炎性通路过程，且有研究表明，ROCK 和NF−κB可减少脓毒症模型中细粒细胞转移及肺水肿表征，减少炎性因子表达，进而缓解脓毒症引起的肺组织病变［17−18］.基质金属蛋白酶（MMP）家族蛋白在细胞凋亡中担任重要角色，其可通过多种途径分解细胞外基质，其中MMP−9 和MMP−2 是最有代表性的关键靶点［19］.研究发现，脓毒症患者体内MMP−9、MMP−2 表达显著提高，这一表现直接提示患者预后不佳并增加器官衰竭的几率［20］.

3.3 通路分析

通过GO 功能富集分析可知，刺梨干预脓毒症的生物学进程有regulation of kinase activ⁃ity、protein tyrosine kinase activity、apical part of cell 等，通过KEGG 富集分析可知，刺梨干预脓毒症的信号通路主要与调节细胞凋亡相关，例如：Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway.

Phospholipase D signaling pathway 是存在细胞内的一种关键的次级信号传递系统，包括催化磷脂酰胆碱水解过程，是机体内PI3K/AKT、MAPK/ERK 及PKC 等信号通路的重要活性底物.Endocrine resistance pathway 是机体内分泌调节的重要通路，其下游包括PI3K/AKT、MAPK 及Apoptosis 等关键通路，与Phospholi⁃pase D signaling pathway 有较强的相关性.研究发现，PI3K/AKT 通路是生物体重要的信号转导通路，是目前唯一明确的自噬调节信号通路［21］，可通过调控细胞自噬减轻脓毒症引起的多器官功能障碍综合征［22］.自噬和脓毒症关系密切，在脓毒症的早期便存在细胞自噬，并且表现为短暂的活性升高趋势，但随着早期高动力状态下消耗大量的自噬前体，在脓毒症后期表现为噬障碍，自噬的清除保护作用失效，导致脓毒症晚期出现免疫麻痹的现象［23］.此外，多数研究也通过动物实验验证了这一观点［24］，其中包括了槲皮素对PI3K/AKT通路的调节作用，这与刺梨干预脓毒症的成分分析结果一致.MAPK 是与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等通路的关键交点，其以磷酸化为特征激活，参与细胞调节功能［25］.MAPK 信号通路可调控氧化应激反应、炎症及细胞凋亡等生物过程来调控脓毒症病情进展，在脓毒症动物模型体内的MAPK 通路相关蛋白活性显著增强，因此，抑制MAPK 信号通路的活性也是干预脓毒症的重要手段［26］.

综上所述，脓毒症疾病相关生物信息通路主要与Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway 相关，刺梨可能通过调控PI3K/AKT、MAPK 等信号通路干预脓毒症.

4 结语

本研究利用网络药理学及分子对接相关技术方法，通过靶点预测、蛋白相互作用网络、GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，初步阐明刺梨多成分、多靶点共同调控脓毒症的作用机制.刺梨可能是通过槲皮素、鞣花酸、木犀草素等活性有效成分，作用于AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 等生物靶点，参与PI3K/AKT、MAPK等多条信号通路的调控进而发挥治疗脓毒症的作用.本研究基于科学理论推测刺梨干预脓毒症的作用机制，为刺梨新药效的发现提供理论参考依据，但网络药理学研究仍存在一定的局限性，后续研究团队将持续关注刺梨药理研究进展，并在此基础上结合动物、细胞实验，深入探讨刺梨干预脓毒症的作用机制，为中医药防治脓毒症提供更有效的治疗指南.