LPA对牦牛卵丘细胞扩张因子HAS2、PTGS2和PTX3表达的影响

刘 斌,王 萌,潘阳阳,王靖雷,徐庚全

(甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070)

卵丘细胞(cumulus cells, CCs)与卵母细胞(Oocyte)之间双向的信号传导对于卵泡内微环境的相对稳定至关重要,可促进原始卵泡的生长发育、卵母细胞的减数分裂、排卵、受精及胚胎发育[1-2]。卵母细胞不能直接利用葡萄糖,因此需要CCs通过多种代谢途径将葡萄糖转化为能量,并将其输送给卵母细胞发挥作用[3-4]。同时,CCs中的线粒体功能障碍可影响卵巢功能和生殖能力[4-5]。CCs中多功能蛋白聚糖(versican, VCAN)基因表达水平与早期胚胎形态发育呈正相关,可用于卵母细胞发育能力以及胚胎形态评估[6]。

卵丘扩张是一个重要的生理过程,是卵母细胞在体内正常发育的必要条件,在卵丘扩张过程中相关因子(如透明质酸合成酶2(hyaluronate synthase 2, HAS2)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)和正五聚蛋白3(pentraxin 3, PTX3))可作为生物标记物用于监测卵母细胞或者胚胎的动态发育过程[7-8]。HAS是合成透明质酸(hyaluronic acid, HA)的重要底物。CCs在扩张过程中会产生大量的透明质酸,不仅使卵巢变得具有粘弹性,还促成卵丘卵母细胞复合体 (cumulus-oocyte complex, COCs)在排卵期间通过破裂的卵泡壁逸出,并且有利于向卵母细胞发出信号以恢复减数分裂和精子活动的微环境[9-10]。PTGS2,也称为环加氧酶 2(cyclooxygenase 2, COX2),是前列腺素(PGs) 产生的一种限速酶,在妊娠早期起着至关重要的作用,包括排卵、受精、着床和蜕膜化[11]。PTX3是排卵前小鼠(Musmusculus) CCs中卵母细胞上调最多的基因之一,参与卵丘基质的形成[12]。PTGS2与PTX3基因的缺失可导致不育,这与COCs排卵异常导致卵母细胞受精失败有关[11-12]。卵丘扩张过程中,由HAS2、VCAN和PTX3形成富含HA的卵丘细胞外基质[3]。在排卵前黄体生成素激增,诱导卵丘扩张相关基因(HAS2、VCAN和PTX3)的表达,它们分别控制HA和前列腺素等的表达[13]。

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是一种生物活性化合物,由分泌型磷脂酶A2和溶血磷脂酶D共同作用于膜磷脂产生[14-15]。LPA可以激活6种LPA受体(LPAR1～6),进而调节各种细胞活动,例如细胞增殖、细胞保护和伤口愈合[14-15]。受体(LPAR1～3)介导的LPA信号在正常卵巢和子宫功能的发挥、发情周期的调节,早期胚胎发育、胚胎植入,妊娠维持和分娩过程中发挥作用[16]。卵巢和子宫中LPA信号传导的数据表明,LPA可以通过其对早期胚胎发育的影响直接促进胚胎与母体之间的相互作用[17-18]。LPA通过影响卵母细胞发育和存活,从而影响卵子的质量和数量[17]。LPA还可以通过与其受体LPAR3结合,从而影响胚胎的着床以及胚胎与母体之间的相互信号交流[17]。

牦牛(bosgrunniens)主要生活在青藏高原及相邻的高海拔地区[19-20]。为适应高原的恶劣条件,牦牛具有独特的形态和生理、生化特征。由于牦牛生活的地区环境恶劣、饲养和管理水平较低,其自然繁殖率较低[19-20]。为了改善牦牛人工繁殖技术的效率和成功率,提高牦牛繁殖率,研究牦牛生殖功能和卵丘扩张具有重要的科学与生产意义。有研究表明,添加外源性LPA可以提高奶牛卵母细胞成熟率,降低COCs的凋亡率,维持卵母细胞成熟过程中发育能力相关因子的表达,进而影响囊胚期的基因表达谱[21],但其对YCCs扩张相关因子表达的影响尚不清楚。因此,本研究以LPA为切入点,旨在探讨不同浓度LPA对牦牛卵丘细胞(yak cumulus cells, YCCs)中卵丘扩张因子HAS2、PTGS2和PTX3表达的影响,以期为进一步研究LPA在牦牛生殖方面的功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究过程中所使用的试剂主要有:LPA购于Sigma公司(上海);DMEM F12 培养基(DMEM/F-12)、青霉素、链霉素、磷酸缓冲盐溶液(PBS)均购于 Gibco 公司(美国);透明质酸酶、胰蛋白酶等均购自美国 Sigma 公司。蛋白免疫印迹试验所用蛋白抗体均购于上海艾博抗(Abcam)公司,其他试剂均为国产分析纯。

本研究所使用的仪器主要有:PCR仪(美国,Bio-Rad);SDS-PAGE电泳槽(美国,Rio-Rad公司);恒温培养箱(日本,松下);超灵敏多功能成像仪(美国,GE Healthcare)。

1.2 试验样本采集

牦牛卵巢采自位于甘肃临夏的健康成年(3～4岁)雌牦牛。随后在含1%青霉素和链霉素的无菌盐水中清洗干净后,在25～30 ℃下,4 h内将卵巢送至实验室。

1.3 牦牛卵丘细胞培养及处理

牦牛卵巢用37 ℃含1%青霉素和链霉素的生理盐水清洗3次。使用18～21号针头,从健康的窦状卵泡中吸出卵泡液后,将其转移至培养皿中,在倒置显微镜下挑选出COCs,体外培养成熟,用0.1%透明质酸酶将卵丘细胞消化至脱落。用完全培养基(含10% FBS、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的DMEM/F-12培养基)和透明质酸酶,1 500 r·min-1离心5 min弃去上清液。在培养基中离心洗涤两次后,将细胞重悬后接种于25 cm2细胞培养瓶中,在37 ℃下、5% CO2细胞培养箱中培养。

取第二代YCCs,以3×106个·孔-1的密度将YCCs接种于六孔细胞培养板。当细胞生长至60%～70%时,DMEM/F-12饥饿12 h,使细胞处于同一细胞周期,然后加入LPA (空白对照、阴性对照、5、15、30和50 μmol·L-1)[21-22]培养24 h,收集样品用于后续试验。

1.4 细胞活性试验

将传代培养至第二代的YCCs以5×104个·mL-1的密度接种在4个96孔板中,每孔100 μL,培养24 h。随后弃掉培养基,在各孔中加入不同浓度的LPA和DMEM/F-12培养基,4个96孔板分别于37 ℃细胞培养箱中孵育12、24、36、48 h后,去除培养液。向每孔中加入100 μL DMEM/F-12培养基,并加入10 μL CCK-8试剂,继续培养2 h,450 nm处检测各孔吸光度。

1.5 RNA提取和逆转录酶聚合酶链反应(RT-qPCR)

用微量RNA提取试剂盒提取总RNA,然后使用两步法反转录试剂盒将其反转录为互补cDNA。将得到的cDNA扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,验证产物的完整性及引物的特异性。

使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒,在LightCycler®480 Instrument II上以20 μL的反应体系进行3次重复反应。使用Primer Premier 6.0设计靶基因和参考基因引物序列(表1),RT-qPCR 反应体系由 cDNA (1 μL)、引物 (10 pmol·mL-1, 0.8 μL)、SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)和 ddH2O (7.4 μL)组成。RT-qPCR条件为95 ℃ 10 min(预变性),95 ℃ 15 s(DNA变性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 18 s(延伸),72 ℃ 10 min(最终延伸),共45个循环。使用β-actin作为参考基因,在3个重复中量化每个样品中的基因表达水平。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列信息

1.6 Wstern blot

用PBS清洗六孔板中的CCs,加入蛋白裂解缓冲液,使CCs彻底裂解。然后加入蛋白上样缓冲液,内含十二烷基硫酸钠(SDS),金属浴15 min使蛋白变性。变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。通过湿转法转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭蛋白质4 h。加入一抗(HAS2(1∶800稀释);PTGS2(1∶800稀释);PTX3(1∶500稀释);β-actin抗体(1∶8 000)稀释)后,在4 ℃下孵育PVDF膜过夜,然后进行PBST清洗。以Goat Anti-Rabbit IgG/HRP抗体为二抗(稀释比例1∶8 000)室温孵育1 h并用PBST清洗。使用电化学发光(ECL)试剂盒曝光,并由Amersham Imager 600拍照。蛋白质条带的IOD值(蛋白质表达水平=目的IOD/内部参考IOD)通过Image-Pro Plus软件测量。

1.7 免疫荧光染色检测卵丘细胞扩张因子的表达

细胞生长稳定后,DME/F12培养基饥饿培养12 h。基于 Western blot的研究结果,分别选择空白对照组、15 μmol·L-1处理组调控YCCs 24 h。在室温下用4%多聚甲醛固定1 h后,使用PBS清洗3次,5 min·次-1。然后用0.2% TritonX-100将YCCs细胞膜透化8 min。使用PBS清洗3次,5 min·次-1。接下来,用2% BSA封闭1 h。按照1∶200稀释比例添加HAS2、PTGS2、PTX3的一抗,4 ℃孵育过夜。使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。添加二抗(Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG , 1∶1 000稀释) 室温孵育1 h。使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。用DAPI对细胞核染色5 min,使用PBS清洗3遍,5 min·次-1。用荧光显微镜观察并拍照。

1.8 数据分析

使用SPSS 22.0(SPSS Inc,美国)进行统计分析。Graphpad prism 8.0用于制图。所有数据均以“平均值±SD”表示,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 牦牛卵丘细胞体外培养

在YCCs接种培养瓶6 h后,CCs开始贴壁生长。并且随着培养时间的增加,CCs开始聚集,细胞间的间隔逐渐减小。最终,在培养瓶底部形成大小均一,形态良好的CCs (图1)。细胞呈梭型或多边形。

图1 体外传代培养的牦牛卵丘细胞(10×)Fig.1 In vitro cultured yak cumulus cells at passage (10×)

2.2 LPA对牦牛卵丘细胞活性的影响

LPA孵育不同时间对牦牛卵丘细胞活性影响的结果如图2所示:当孵育时间为12 h时,与空白对照组相比,各浓度的LPA对细胞活性均有明显的促进作用(P<0.05)。随着LPA浓度的增加及孵育时间的延长,LPA对细胞活性的促进作用均逐渐增强。当孵育时间为24 h时,与空白对照组相比,各浓度LPA对细胞活性的促进作用最明显(P<0.05)。当孵育时间为36 和48 h时,LPA对细胞活性的促进作用逐渐下降。相比较于对照组而言,当LPA浓度为15 μmol·L-1时,不同孵育时间中YCCs的活性提升最为显著(P<0.05)。

A、B、C和D分别为LPA孵育12、24、36 和48 h对牦牛卵丘细胞活性的影响。柱形图中不同字母表示差异显著(P<0.05),下同A, B, C and D show the effects of LPA incubation for 12, 24, 36 and 48 h on the viability of yak cumulus cells. In the bar chart, the different letters indicate significant difference (P<0.05), the same as below

2.3 LPA对牦牛卵丘扩张相关因子表达的影响

RT-qPCR结果显示,LPA对牦牛CCs中卵丘扩张相关因子HAS2、PTGS2、PTX3的表达在5～50 μmol·L-1范围内表现出一定的促进作用。当LPA浓度为15 μmol·L-1时,与空白对照组相比,HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的相对表达水平达到最高(图3,P<0.05)。当LPA浓度大于15 μmol·L-1时,HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的表达水平降低,但与空白对照和阴性对照组相比仍然差异显著(P<0.05)。

图3 不同浓度LPA处理后YCCs中HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的相对表达水平Fig.3 Relative expression levels of HAS2,PTGS2 and PTX3 mRNA in YCCs treated with different concentrations of LPA

2.4 LPA对YCCs卵丘扩张相关蛋白表达的影响

Western blot用于检测LPA处理后CCs中目标蛋白质的表达水平(图4)。LPA处理的YCCs中卵丘扩张相关蛋白HAS2、PTGS2、PTX3的表达在5～50 μmol·L-1范围内表现出一定的促进作用。当LPA浓度为15 μmol·L-1时,与空白对照组相比,HAS2、PTGS2、PTX3 蛋白的相对表达水平达到最高(P<0.05)。当LPA浓度大于15 μmol·L-1时,HAS2、PTGS2、PTX3 蛋白的表达水平降低。

A、B、C图中:上部分为HAS2、PTGS2、PTX3 Western blot条带图。从左到右依次为空白对照组、阴性对照组、5 μmol·L-1、15 μmol·L-1、30 μmol·L-1、50 μmol·L-1处理组。下部分分别表示不同浓度LPA处理后牦牛CCs中HAS2、PTGS2、PTX3蛋白的相对表达水平In figure A, B and C: The upper part is divided into HAS2, PTGS2 and PTX3 Western blot strip. From left to right are blank control group, negative control group, 5 μmol·L-1, 15 μmol·L-1, 30 μmol·L-1, 50 μmol·L-1 treatment group. The following sections respectively show the relative expression levels of HAS2, PTGS2 and PTX3 proteins in yak CCs treated with different concentrations of LPA

2.5 免疫荧光染色检测牦牛卵丘细胞中卵丘扩张因子相关蛋白的表达与分布

分别选择15 μmol·L-1处理组,即卵丘扩张相关蛋白在Western blot试验中相对表达水平最高的一组,以空白组为对照,检测YCCs中卵丘扩张相关蛋白的表达与分布。免疫荧光结果显示(图5),卵丘扩张相关蛋白HAS2、PTGS2、PTX3均在YCCs中表达,主要在细胞质中表达,核表达较弱。而LPA处理后的样本,卵丘扩张相关蛋白在CCs细胞质中的荧光标记显著增强,这说明LPA能够参与卵丘扩张因子相关蛋白的分泌过程。

红色荧光为靶蛋白,蓝色荧光为细胞核。从左往右每一列分别表示目标蛋白、细胞核和叠加图像。从上往下每一行分别表示HAS2、PTGS2、PTX3空白对照组与15 μmol·L-1处理组Red fluorescence is target proteins and blue fluorescence is nucleus. Each column from left to right represents the target protein, nucleus, and merge. Each row from top to bottom represents the HAS2, PTGS2, PTX3 blank control group, and 15 μmol·L-1 treatment group, respectively

3 讨 论

卵丘扩张是卵巢释放可受精卵的必要条件,对哺乳动物的正常受精至关重要[23]。卵丘扩张可使COCs从卵泡壁松动和分离,最终被输卵管接纳。HAS2、PTGS2和PTX3参与调节卵丘基质功能和卵丘扩张过程,这表明卵丘扩张因子可以帮助预测卵母细胞质量以及随后的胚胎发育过程[24-25]。小鼠(Musmusculus)敲除LPA3基因后,胚胎植入子宫壁的时间和间隔受到影响[26],而小鼠敲除LPA1、LPA2、LPA3基因后,精子产量降低,交配活动降低,随后出现与年龄相关的无精子症[27]。这说明LPA在雄性和雌性动物生殖系统中都发挥着重要作用,但是它们对牦牛CCs的调节机制尚不清楚。因此本试验以CCs为研究对象,探究不同浓度LPA对卵丘细胞中HAS2、PTGS2和PTX3表达的影响,从而为提高牦牛卵母细胞的质量和体外受精(invitrofertilization, IVF)成功率的研究提供理论基础。

CCs凋亡率与卵母细胞的成熟、受精及IVF后的妊娠结局呈负相关[28]。在接受IVF过程之前,如果雌性缺乏CCs,可能会影响卵巢功能和卵泡发育,对胚胎的质量和发育速度产生负面影响,甚至可能导致切割和胚胎发育的速度变慢[3-29]。本研究结果显示,LPA可以增强CCs中卵丘扩张因子HAS2、PTGS2、PTX3的表达,且其作用浓度具有剂量依赖性,最佳浓度为15 μmol·L-1。LPA孵育12、24、36和48 h,对牦牛卵丘细胞的活性有着明显的促进作用。卵丘扩张过程中,卵丘细胞和卵母细胞逐渐增大,并伴随着细胞增殖。在牛卵母细胞体外成熟(invitromaturation, IVM)期间进行LPA处理增加了抗凋亡因子(B-cell lymphoma-2,Bcl-2) mRNA的表达。此外,用LPA处理猪和牛胚胎导致抗凋亡因子Bcl-2 mRNA表达增加,促凋亡基因Bax和钙蛋白酶Ⅰ的表达降低[30-31]。LPA或许也是通过这种方式促进YCCs的活性。LPA能够刺激细胞增殖,并且在小鼠中,COCs IVM期间进行LPA处理可诱导HA的产生,从而增强卵丘细胞扩增并刺激卵母细胞成熟。添加成纤维细胞生长因子受体抑制剂多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂 (SU5402)可以显著阻断卵丘扩张。添加SU5402还抑制了卵丘扩张相关基因HAS2和PTX3的表达[32-33]。这说明卵丘细胞活性的变化或许和卵丘扩张因子有关。因此,本研究通过LPA促进卵丘扩张相关基因表达,可能在一定程度上影响卵丘细胞功能的发挥以及调节牦牛生殖过程。卵丘扩张在卵母细胞成熟中起着重要作用,与未能扩张的卵丘细胞相关的卵母细胞无法排卵或受精[17]。卵丘细胞为卵母细胞提供了营养物质、生存因子、生长因子以及各种信号分子,这些物质能够使卵泡内的卵母细胞达到减数分裂的能力[34]。有研究表明,PTGS2、HAS2高表达的卵丘细胞相比较低表达水平的卵丘细胞而言,能产生更高质量的卵母细胞和胚胎[35-36]。小鼠PTGS2、PTX3基因的缺失导致卵丘扩张缺陷,排卵受损以及雌性动物不孕[3]。这进一步说明采取一定的措施来保证卵丘扩张基因的正常或者高表达是有必要的。有研究表明,与未受精或发育成低质量胚胎的卵母细胞相比,发育成高质量胚胎的卵母细胞具有更高的HAS2和COX2转录水平[37]。添加外源性LPA后,奶牛(vitulus) CCs中HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA的表达水平在各处理组间并无明显差异[17]。而本研究结果表明,外源性LPA能够促进它们的表达,并且在15 μmol·L-1促进作用最为显著。这或许是因为奶牛与牦牛之间存在种属差异,以及牦牛在适应环境的过程中发生的特异性改变。

先前有研究表明,LPA可以通过激活细胞外信号调节激酶途径/蛋白激酶B(ERK/Akt)信号通路来调节伤口愈合、血液凝固、血压维持和细胞过程,如存活、增殖、分化、迁移、形态和粘附[38-39]。而ERK1/2信号通路被激活后,可以进一步诱导HAS2、PTGS2、PTX3的表达[40]。LPA能够促进牦牛生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的表达,而GDF9已被证实在卵丘细胞中能诱导HAS2、PTGS2、PTX3的表达,并最终预测卵母细胞活性[41]。在本研究中,发现添加LPA显著增强牦牛卵丘细胞中HAS2、PTGS2、PTX3的表达,提示外源添加的LPA可能对牦牛卵母细胞体外培养过程中卵丘扩展有作用,其作用机制可能与激活ERK1/2信号通路和诱导CDF9表达有关, 但其具体影响机制还有待进一步研究。

4 结 论

本研究表明,LPA对YCCs活性具有促进作用。当孵育时间为24 h,并且LPA浓度为15 μmol·L-1时,活性提升最为显著。LPA可以增强CCs中卵丘扩张因子HAS2、PTGS2、PTX3的表达,且其作用浓度具有剂量依赖性,最佳浓度为15 μmol·L-1。本研究为阐明LPA促进牦牛卵丘细胞扩张的分子机制提供了理论依据,为进一步提高牦牛卵母细胞的质量和体外受精成功率提供理论基础。