薰衣草DXR基因在转基因烟草中的功能分析

王振昱，苏秀娟

（1.新疆农业大学农学院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000；2.新疆作物遗传改良与种质创新重点实验室，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000）

薰衣草（LavandulaangustifoliaM.）为多年生的亚灌木，是一种观赏价值较高的天然香料植物，具有浓郁的芳香气味[1]。由薰衣草花穗提炼而获得的植物精油是一种挥发性精油，其主要成分为芳樟醇等萜类化合物[2]。萜类化合物合成途径包括6个酶反应步骤组成的甲羟戊酸途径（MVA）和7 个酶反应步骤组成的甲基赤藓糖醇磷酸途径（MEP），其中MVA 途径主要合成倍半萜和三萜，而MEP 途径参与合成单萜和二萜等次生代谢产物[3]。DXR为MEP 途径中第二步催化反应的关键酶，催化DXP转化为MEP，是调控植物萜类物质生物合成的有效靶点。

DXR基因在多种植物中被克隆并分离出来，随着研究的深入，DXR基因的功能及调控机制也越来越明确。过表达蓝藻DXR基因能够引起转基因烟草中叶绿素a、β-谷甾醇增加[4]；过表达DXR基因的薄荷叶片中的挥发油含量对比野生型植株提高了50%[5]。因此，通过基因工程技术手段增加萜类合成酶基因的表达量，是提高植物萜类化合物产量的有效途径。本研究通过农杆菌介导法获得了转DXR基因的烟草植株，采用荧光定量技术确定了其在不同转基因植株中的表达量，利用GC-MS技术测定了转基因植株叶片中萜类挥发物的含量情况，初步明确了薰衣草DXR基因的功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以普通烟草（NicotianatabacumL.）为材料。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草叶片侵染

将含有pCAMBIA3301-DXR质粒的农杆菌菌液在添加50 mg/mL 卡那霉素和利福平的YEB 培养液中28 ℃、220 r/min培养24 h后，接入新鲜YEB培养液继续培养至菌液OD 值为1.0～1.2，4 000 r/min 离心10 min，MS 液体培养基重悬菌液OD 值为0.6～0.8。将烟草叶片切成0.5 cm×0.5 cm 小块，放入农杆菌重悬菌液中浸泡15 min，取出叶片置于无菌滤纸上吸干残液，将其接种在叶片分化培养基（铺一层滤纸）中28 ℃暗培养2 d后，将其接种于筛选培养基。待叶片分化出的抗性芽生长至1.5 cm左右时，将其转入生根培养基。

1.2.2 转基因烟草的PCR鉴定及表达量分析

使用改良CTAB 法提取烟草基因组DNA，用DXRF（ATGGCTCTTAATTTGACGTCTCC）和DXR-R（TTAG ACAAGAGCGGGAGTACTCAAA）引物组合检测过表达DXR基因的烟草植株。提取烟草总RNA，反转录为cDNA，并将其稀释至100～200 ng/μL。以Actin 为内参基因，每个样品进行3 次重复，反应程序选用两步法：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。用2-△△Ct 法计算平均值及标准差，使用SPSS 软件对数据进行显著性分析。

1.2.3 转基因烟草的萜类挥发物测定

选取生长状况良好的野生型及转基因植株叶片，采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）对样品成分进行分析。

2 结果与分析

2.1 烟草抗性植株的PCR鉴定

以抗性烟草小苗叶片DNA 为模板，经DXR-F 和DXR-R 特异引物组合的PCR 检测，10 株抗性植株中均含有与目的基因大小一致的条带，如图1 所示，条带清晰且单一，初步证明该基因已经转入烟草中。

图1 DXR转基因抗性烟草PCR检测Fig.1 PCR detection of DXR transgenic resistant tobacco

2.2 转基因烟草中DXR基因的表达量分析

提取阳性烟草植株的RNA，检测DXR基因表达量。结果表明，DXR基因在转基因株系中均有表达，其表达水平存在株系间差异，其中该基因在OE-2、OE-3、OE-4、OE-13、OE-14、OE-18、OE-19、OE-20 表达量明显高于其在野生型烟草中的表达量，具体情况如图2 所示，分别为41.45 倍、19.57 倍、100.9 倍、31.94 倍、135.9 倍、101.69倍、97.76倍、89.15倍。

图2 转基因烟草DXR的表达量检测Fig.2 Detection of DXR expression in transgenic tobacco

图3 DXR转基因烟草株系单萜化合物含量情况Fig.3 Contents of monoterpene compounds in DXR transgenic tobacco lines

2.3 转基因烟草花香萜类物质的分析

未发现转基因烟草和野生型烟草的表型有明显差异。选取DXR基因表达量最高的转基因烟草株系OE-14和野生型植株为样本，比较其萜类物质含量的差异。转基因烟草中单萜挥发物含量占挥发物总量的4.3%，其含量显著高于对照，比对照高出1.42 倍。具体情况如图所示，过表达DXR基因并未引起烟草中二萜化合物含量发生变化。因此，过表达DXR基因可以提高转基因植株的单萜化合物含量。

3 讨论

萜类化合物一般由多个异戊二烯（C5）单元组成，按照萜类化合物在植物中发挥的不同作用，可以被分为初生代谢产物和次生代谢产物两大类[6]。在植物次生代谢物中，萜类化合物是结构和数量种类比例最高的化合物，目前已从植物中分离出多种萜类化合物及其衍生物[7]。不同类型萜类化合物的合成和积累依赖于代谢途径中关键酶的作用，这些酶通常位于合成途径的分支点，催化各种前体和中间体的形成[8]。因此，可以通过对关键酶基因的克隆和表达来研究植物香气的合成机理。过表达DXR基因会提高青蒿中的青蒿素的含量[9]。Veau[10]等克隆了长春花DXR基因，发现其表达水平与单萜物质吲哚生物碱含量变化相关。过表达DXR基因会增强拟南芥叶绿素等异戊二烯类化合物的生成[11]。本研究利用农杆菌介导法获得了10 株转基因烟草，转基因烟草中DXR基因的表达水平有明显提高。转基因烟草中单萜化合物含量比对照植物增加了1.42倍，表明过表达薰衣草DXR基因可以提高烟草单萜化合物含量，与Veau 等的研究结果一致。因此，DXR基因过表达可以改变MEP途径的代谢通量。

4 结语

本研究中转基因烟草中DXR表达量与单萜化合物含量呈正相关，这为进一步探究DXR基因在薰衣草萜类合成中的调控机制奠定了基础，也为薰衣草精油产量与品质提供了候选基因。