有机物对ANAMMOX性能及微生物影响的研究进展

骆子琛，李星燃，王建芳，，3，4

（1.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州 215009； 2.苏州科技大学天平学院，江苏苏州215009； 3.城市生活污水资源化利用技术国家地方联合工程实验室，江苏苏州215009；4.江苏高校水处理技术与材料协同创新中心，江苏苏州 215009）

厌氧氨氧化工艺（ANAMMOX）是指在厌氧条件下，厌氧氨氧化菌（AnAOB）以亚硝酸盐（NO2--N）为电子受体，氧化氨氮（NH4+-N）为氮气（N2）的一种高效低耗的废水脱氮工艺〔1〕。迄今为止，全世界建有约两百多个全规模ANAMMOX处理系统，主要应用于侧流高浓度氨氮废水（如垃圾渗滤液、制药废水、污泥消化液等）的处理〔2-4〕。相对于传统硝化-反硝化工艺，ANAMMOX无需添加外部有机碳源，污泥产量可下降80%～90%〔5〕。然而，ANAMMOX的应用仍然面临AnAOB增殖时间长、对环境因素（如有机物）敏感度较高等诸多挑战。

在过去的十年间，研究ANAMMOX的文章以每年约14%的增速增长，其中涉及到有机物影响方面的研究就高达27%〔6〕。有研究表明，过高的有机物含量会通过多种途径抑制AnAOB的活性，认为高的有机物含量会对AnAOB酶活造成不可逆转影响，致使细胞失活，进而影响ANAMMOX的性能〔7〕。Zhengzhe ZHANG等〔8〕发现过高的有机物浓度会造成异养细菌大量繁殖，与AnAOB竞争NO2--N，例如Thauera和Denitratisoma更倾向于利用NO2--N作为电子供体〔6〕。然而，更深入的研究发现一定浓度的有机物可对ANAMMOX产生促进作用〔9〕。目前的研究主要集中在有机物对协同体系和单一ANAMMOX体系脱氮性能的影响、不同体系中微生物群落对有机物的影响，这对反应器稳定运行、保持微生物群落之间的平衡至关重要。

笔者论述了有机物类型、浓度对ANAMMOX脱氮体系效能和对功能微生物的影响，并探讨了原因，揭示了ANAMMOX系统对有机物的耐受度及有机物对AnAOB的影响机制，优化有机物存在下ANAMMOX系统的脱氮性能，为ANAMMOX工艺工程化应用提供参考。

1 有机物对单一ANAMMOX运行性能及微生物群落的影响

通常认为ANAMMOX是以HCO3-作为无机碳源进行代谢的自养脱氮工艺，HCO3-在900～1 500 mg/L可提高AnAOB的活性〔10-11〕。关于有机物对ANAMMOX系统的影响，国内外学者持有不同的观点。有研究认为，有机物的存在会对ANAMMOX系统的脱氮效果、微生物群落及活性产生抑制作用〔12〕。但也有研究发现，有机物可参与到ANAMMOX的运行过程中，AnAOB具有代谢有机物的能力〔13〕。

在已发现的6个ANAMMOX属中，有5个属的AnAOB可以利用简单的有机酸〔6〕。Candidatus Jettenia和Candidatus Brocadia均具有代谢乙酸盐的能力〔14-15〕。部分AnAOB代谢有机物的能力甚至强于异养反硝化细菌〔16〕。

总的来说，有机物的类型、浓度对AnAOB活性有重要影响，笔者将论述有机物类型、浓度对AnAOB活性以及微生物种群竞争的影响。

1.1 低浓度有机物对AnAOB的促进作用及机理

1.1.1 低浓度常规有机物对AnAOB的促进作用

微生物对有机物的利用与有机物类型、分子结构密切相关。污水中各类常规有机物（如甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐和葡萄糖等）对ANAMMOX系统性能均有影响。小分子有机物（甲酸盐、乙酸盐）极易被微生物利用，AnAOB易于将乙酸盐转化为乙酰辅酶A后固碳〔17〕，最终实现以乙酸盐为碳源进行代谢（图1）。在ANAMMOX工艺中，投加少量乙酸盐（COD＜100 mg/L）会提高AnAOB活性，缩短ANAMMOX启动时间，提高脱氮性能。Xuejiao YIN等〔18〕发现加入少量乙酸钠（COD 82 mg/L）可将AnAOB的生长速率提高3倍以上，启动时间缩短20 d左右。Zhengzhe ZHANG等〔8〕以乙酸盐作为碳源（COD为84 mg/L），ANAMMOX系统总氮去除率（TNRE）提高，浮霉菌门（Planctomycetes）丰度明显上升，Candidatus Kuenenia丰度提高6.37%。

图1 不同碳源代谢途径机理及竞争抑制原理Fig.1 Mechanisms of metabolic pathways of different carbon sources and the principle of competitive inhibition

甲酸盐作为结构最简单的有机物，在低浓度条件下对ANAMMOX脱氮效能也具有一定的促进作用。研究发现当甲酸盐质量浓度＜100 mg/L时，可提高AnAOB的活性〔19〕。

丙酸盐和葡萄糖相较乙酸盐及甲酸盐代谢途径更为复杂，但这2种有机物对应的COD低于100 mg/L，对AnAOB群落仍然具有一定促进效果。Yuhai LIANG等〔20〕发现，在丙酸盐质量浓度逐步上升到30 mg/L这一过程中，TNRE提高3.2%，Candidatus Jettenia丰度由0.03%上升到3.84%。研究者发现，低浓度的葡萄糖对AnAOB有促进作用。刘金苓等〔21〕研究发现葡萄糖对应的COD为90 mg/L时，NO2--N和NH4+-N去除率分别提高26.5%和47.6%。Chongjun CHEN等〔22〕证 实 当COD为50 mg/L时，NH4+-N去除率达97.23%，ANAMMOX性能并没有受到影响，Planctomycetes丰度上升5%左右。

1.1.2 低浓度常规有机物提升AnAOB活性的机理

有机物提升ANAMMOX工艺脱氮性能及AnAOB微生物活性的路径与碳源类型有关。甲酸盐对ANAMMMOX的促进原因归纳如下：甲酸盐可以直接被AnAOB通过Wood-Ljungdahl途径的甲基分支同化〔23-24〕；从热力学角度分析，氧化甲酸盐可释放出更多的能量〔6〕，从而使得甲酸盐更易于被微生物利用。乙酸盐提高ANAMMOX性能可能与其促进AnAOB相关功能酶的合成有关。例如CandidatusKuenenia具有乙酰辅酶A的合成酶（ADP-ACS），在乙酸盐投加量较低的情况下，ADP-ACS的丰度上升了35.1%，而ADP-ACS可催化乙酸盐到乙酰辅酶A的转化〔25〕。丙酸盐及葡萄糖则需分别通过SBM途径（Sleeping Beauty Mutase）、糖酵解途径转化成琥珀酰辅酶A及乙酰辅酶A（见图1），并进入TCA循环后被AnAOB利用从而达到促进作用〔26-27〕。

1.2 有机物对AnAOB的抑制作用及机理

1.2.1 高浓度常规有机物对AnAOB活性的抑制作用

低浓度常规有机物的存在会一定程度上提升AnAOB活性，但有机物对自养AnAOB的影响相对比较复杂。长期高浓度常规有机物（如乙酸盐、丙酸盐、葡萄糖、乳糖、蛋白胨及脱脂干奶等有机物，COD＞100 mg/L）的存在，会改变ANAMMOX系统中微生物群落结构，致使异养微生物过度生长，与AnAOB竞争基质、生态位，影响ANAMMOX工艺的性能。

ANAMMOX工艺中长期存在高浓度乙酸盐时，反硝化菌可利用有机物反硝化脱氮，自养AnAOB与反硝化菌之间会竞争基质（NO2--N），AnAOB活性被抑制〔28〕。Chongjun CHEN等〔29〕发现，在乙酸盐质量浓度为150 mg/L的体系中，Candidatus Kuenenia丰度降低17.4%，反硝化细菌大量繁殖，ANAMMOX脱氮效能下降。当以葡萄糖为碳源，COD为150 mg/L时，ANAMMOX系统中NH4+-N去除率下降至68.11%，Planctomycetes丰度下降7%左右，典型的菌属Candidatus Kuenenia丰度下降10%，表明AnAOB活性受到一定程度的抑制〔22〕。以丙酸盐为碳源的系统中也出现了类似现象〔30〕，当丙酸盐质量浓度为200 mg/L时，NH4+-N去除率仅70%左右，优势菌种Candidatus Brocadia丰度下降13.7%。研究者还对乳糖、蛋白胨、脱脂干奶等常规碳源的影响进行了研究，发现COD越高，对ANAMMOX的抑制效果越强烈〔31-32〕。相对来说，有机物分子质量越小、结构越简单，越容易直接被利用，对AnAOB的影响越显著。

有机物类型及浓度的改变可能导致系统中AnAOB优势菌属存在差异。表1综述了不同类型碳源和不同COD条件下对AnAOB菌属相对丰度的影响。

表1 碳源类型及浓度对AnAOB菌属相对丰度及ANAMMOX运行性能的影响Table 1 Effect of carbon source type and concentration on the relative abundance of AnAOB and the operational performance of ANAMMOX

在有机物存在条件下，AnAOB菌属类型和相对丰度也会发生变化，主要有以下几种情况：1）Candidatus Brocadia可 能 比Candidatus Jettenia、Candidatus Kuenenia更能适应甲酸盐、乙酸盐的存在，因为Candidatus Brocadia对小分子有机酸的利用率更高，具有较强的竞争力和耐受力〔37-38〕；2）在丙酸盐存在的条件下，Candidatus Jettenia具有更强的适应性，这可能是因为该类菌可以更有效利用丙酸盐，从而表现出更好的活性〔15〕；3）Candidatus Kuenenia能够代谢脂肪酸，对碳水化合物（如葡萄糖）的代谢能力较差〔39〕，因此Candidatus Kuenenia更容易受到葡萄糖的抑制。

1.2.2 高浓度有机物浓度对AnAOB抑制性影响的机理探讨

高浓度COD对ANAMMOX产生的抑制影响机制主要有以下几种理论阐释。

1）从吉布斯自由能角度看，异养反硝化比（ΔG=-843 kJ/mol）ANAMMOX更 容 易 进 行（ΔG=-297 kJ/mol）〔40〕。因 此，当ANAMMOX系 统 中 存 在 较 高COD时，微生物倾向于反硝化反应。

2）高COD有利于反硝化细菌的生长，易导致体系中功能微生物群失衡，甚至AnAOB的消亡〔29，40〕，即所谓的“竞争淘汰引发的抑制”的因素。然而其引发的抑制效果可能与“碳源代谢途径的复杂程度”密切相关。研究表明，复杂的代谢方式导致更低的反硝化率，反硝化细菌与AnAOB竞争底物时并不占优势〔41〕。例如，葡萄糖的降解过程需要首先经过糖酵解途径转化为丙酮酸，随后丙酮酸转化为乙酰辅酶A并进入TCA循环，从而为反硝化提供反应所需的电子和能量；丙酸盐的转化途径则需分为两个阶段，即SBM途径和TCA循环（见图1）；而乙酸盐则可以直接转化为乙酰辅酶A，而后进入TCA循环。这就解释了相比乙酸盐，相同浓度的葡萄糖及丙酸盐对ANAMMOX抑制程度较小的原因。

3）在高COD存在的条件下，AnAOB虽可作为优势物种，但并不执行正常的脱氮途径，即AnAOB使用有机物而不是以NH4+-N和NO2--N作为底物〔7，16〕。因此，系统往往表现出脱氮效果恶化。这种现象可以被认为是“转换代谢途径”引发的抑制。某些AnAOB菌属有能力将NO3--N作为电子受体氧化挥发性脂肪酸（VFA），同时以NO2--N作为中间产物生成NH4+-N，即异化硝酸盐还原为铵（DNRA）的最终产物〔42〕。例如Candidatus Brocadiacaroliniensis和Candidatus Brocadiafulgida均已被证明具有进行DNRA的功能基因nrfA，表明这2种微生物可以利用有机物进行DNRA〔18〕。

总之，有机物浓度是影响ANAMMOX性能的重要因素。COD低于100 mg/L，可提高AnAOB的功能酶活性，促进AnAOB与反硝化细菌等微生物协同获得更高的TNRE；当COD高于100 mg/L，则主要体现“竞争淘汰”及“转换代谢途径”，一定程度上对AnAOB产生抑制，通常COD越高，抑制效果越强烈。因此，维持合理的有机物浓度，对反应器高效脱氮及微生物群落结构的稳定具有重要意义。根据系统中AnAOB优势菌属对不同类型有机物的适应性，“对症下药”，促进ANAMMOX工艺的快速启动和稳定运行，并为后续研究提供参考。

1.2.3 有毒有机物对AnAOB的抑制性影响

常见的有毒有机物如醇类、酚类、抗生素等都会对ANAMMOX产生抑制效果。这类有机物一般通过抑制AnAOB功能酶以及阻碍细胞蛋白质合成等方式影响ANAMMOX。

1）甲醇。甲醇超过一定浓度会对ANAMMOX有强烈的抑制作用，甚至会造成不可逆转的影响〔7〕。甲醇可被AnAOB中羟胺氧化还原酶（Hao）氧化为甲醛，再与肽链交联造成酶和蛋白质损伤，从而使AnAOB失活〔43-44〕。K.ISAKA等〔45〕研究发现，随着甲醇浓度的提高，AnAOB活性逐渐下降。M.M.JENSEN等〔46〕发现加入3.3 mmol/L甲醇时，AnAOB活性下降到2%，甲醇浓度越高对AnAOB毒害作用越强烈。

2）酚类。酚类物质主要存在于某些工业废水中，如造纸废水、纺织废水、化工废水和制药废水等〔47〕，对AMAMMOX会产生较大影响。苯酚是酚类物质出现的常见形式，通过与AnAOB肼合成酶（Hzs）的α和γ亚基结合竞争蛋白质，抑制AnAOB活性。但不同于甲醇，苯酚对AnAOB的毒害往往快速且可逆〔48〕。苯酚对AnAOB的抑制可能与接触苯酚的时间长短有关。短期内可通过抑制关键酶的活性抑制AnAOB的活性，长期影响则可改变微生物群落结 构〔48〕。Guopeng WANG等〔49〕发 现 苯 酚 可 以 使ANAMMOX的SAA（specific anammox activity）在5 d内下降80%；A.D.PEREIRA等〔50〕发现添加苯酚42 d后，ANAMMOX适应苯酚，SAA仅下降49.5%。通过降低进水苯酚浓度、进水负荷、更新部分污泥等方式，可使苯酚胁迫下的ANAMMOX性能得以快速恢复〔49，51〕。

通过比较甲醇、苯酚的存在对不同属AnAOB相对丰度及ANAMMOX性能的影响，发现：Candidatus Brocadia比Candidatus Jettenia、Candidatus Kuenenia对 苯 酚 有 更 高 的 适 应 性〔48，52〕；相 较 于Candidatus Jettenia asiatica和Candidatus Jettenia caenia，Candidatus Kuenenia stuttgartiensis对甲醇有更高的适应性；Candidatus Kuenenia stuttgartiensis比Candidatus Brocadia sinica对甲醇的耐受度更高〔53-54〕。

3）抗生素。抗生素通过阻碍蛋白质和细胞壁的合成，与细胞膜的相互作用以及抑制DNA转录和复制〔4，55-56〕，抑制有害细菌的生长、繁殖和代谢，已被广泛用于医学、工业、畜牧业和水产养殖业中〔57〕。不同抗生素对ANAMMOX抑制效果具有差异，Zhengzhe ZHANG等〔58〕研究3种抗生素（阿莫西林、氟苯尼考、磺胺甲素）对ANAMMOX系统SAA的影响，16 d内3个反应器SAA分别下降50%、44%、48%。此外，抗生素抑制对AnAOB的影响与污泥形态有关，附着态污泥能更好地抵御抗生素的毒害作用。S.PHANWILAI等〔59〕在连续投加27 d 6 mg/L的氯霉素后发现，絮状污泥和附着污泥SAA分别下降82%和71%。抗生素对AnAOB的抑制与抗生素类型、抗生素浓度、污泥形态均存在较为密切的联系。在添加抗生素的ANAMMOX系统中，AnAOB可以表现出对低浓度抗生素的适应性〔58，60〕，而SAA的恢复以及抗生素抑制效果的减缓，可能与系统中EPS含量增加、微生物丰度提高以及微生物对抗生素的适应性上升有关。

在上述有毒有机物中，抗生素和酚类的抑制效果往往是可逆的，而醇类例如甲醇则表现出极强的抑制作用，并且大多数醇类的抑制都是不可逆的。此外，不同菌属AnAOB对有毒有机物表现出不同的耐受性；污泥形态不同所表现出的抑制作用也不尽相同，总的来说，颗粒污泥和生物膜比絮状污泥具有更高的耐受性。

2 有机物对ANAMMOX与反硝化竞争和协同的影响

2.1 C/N对AnAOB和反硝化菌协同体系的影响

低浓度有机物长期存在于ANAMMOX体系中，反硝化菌与AnAOB可在同一环境下共存。由于反硝化菌具有更高的生长率（产量系数0.27～0.3＞0.066）〔61-62〕，如不严格控制反应条件，反硝化菌将压缩AnAOB生长空间，并最终抑制ANAMMOX脱氮性能。

合理的C/N是反硝化菌与AnAOB互利共生的重要条件。反硝化分为完全反硝化及短程反硝化（Partial denitrification，PD），通常C/N影响反硝化的程度。较高的C/N更容易发生完全反硝化，反硝化菌将与AnAOB竞争共同的“NO2--N”基质，从而对ANAMMOX产生抑制效果。而在较低的C/N下，反硝化进程终结在短程反硝化阶段，NO3--N还原为NO2--N，可有效降低废水中有机物含量及减少温室气体排放，中间产物NO2--N为AnAOB提供基质。

为探究最佳的进水C/N，国内外学者做了大量的研究。当C/N＜2.6时，尽管AnAOB仍是优势菌，其活性会受到一定程度的抑制，PD反应也未得到充分发挥〔63-65〕。当C/N在2.6～3.5范围内，AnAOB可协同反硝化菌获得良好的脱氮效果。Jingwen ZHANG等〔66〕在SBR反应器中将C/N控制在2.6，反应器平均总氮去除率（TNRE）为81.2%，ANAMMOX对TN去除的贡献率达83.6%。Shuzhe DING等〔67〕在SBR反应器中将C/N控制在3.5，实现86.1%的TNRE，其中ANAMMOX对TN去除的贡献率高达89%。然而，当C/N＞3.5时，AnAOB与反硝化菌在竞争基质与空间中逐渐处于劣势，反硝化反应逐渐转化为完全反硝化，并开始占据主导地位，AnAOB活性受到较大抑制。Jianwei LI等〔68〕利用MBBR反应器探究较高C/N对ANAMMOX及反硝化脱氮贡献率的影响发现，当C/N＞4时，ANAMMOX脱氮贡献率仅15.9%，反硝化较ANAMMOX的脱氮贡献率高68.2%。因此，维持进水C/N在2.6～3.5，可实现AnAOB与反硝化菌的互利共生，达到理想的脱氮效果。

2.2 协同作用中微生物群落结构变化研究

有机物存在条件下，ANAMMOX体系中最主要的AnAOB和反硝化菌分别属于Planctomycetes、变形菌门（Proteobacteria），但进水C/N的差异会导致以上2种微生物相对丰度及优势菌属存在较大差异。在低C/N的环境中，Planctomycetes和Proteobacteria的相对丰度分别在2.54%～10.08%及31.15%～64.73%〔69〕。当环境中C/N在2.6～3.5时，Planctomycetes和Proteobacteria的相对丰度分别在12.88%～24.2%及40.69%～53.5%〔70〕。Thauera（Proteobacteria的一种菌属）被认为是短程反硝化的功能菌，其活性直接影响短程反硝化耦合厌氧氨氧化（PD-A）脱氮性能〔71〕，合理的C/N有利于提高功能微生物的丰度。Qi ZHAO等〔72〕发现当C/N为3.2时，Thauera丰度上升5.27%，Candidatus Brocadia丰度上升1.99%。当C/N＞3.5时，Proteobacteria往往呈现出较高丰度，可达55%～65%，Planctomycete受到抑制，其相对丰度下降至0.5%～3.53%〔36，68〕。可见，在反硝化耦合厌氧氨氧化体系中，C/N的差异将影响反硝化-ANAMMOX体系中优势种群及其相对丰度，甚至改变反硝化菌及AnAOB中的优势菌属。

3 结语

厌氧氨氧化菌世代周期长，对环境因子敏感，有机物作为污水中最常见的物质，其种类、浓度对ANAMMOX性能及微生物群落都会产生较复杂影响。

1）通常较低浓度简单有机物，如甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐及葡萄糖可通过不同的代谢转化方式被AnAOB利用，对ANAMMOX性能产生明显的促进效果；C/N在2.6～3.5范围内有利于实现ANAMMOX与反硝化的协同，可获得更佳的脱氮效果。

2）较高有机物浓度易导致反硝化菌占优势，以“竞争淘汰”及“转换代谢途径”2种方式与AnAOB竞争基质，甚至改变AnAOB正常的代谢途径，从而抑制AnAOB。通常COD越高，作用时间越长，抑制效果越强烈。

3）甲醇、苯酚、抗生素等有毒物质可通过抑制AnAOB功能酶，阻碍细胞蛋白质合成等方式影响AnAOB代谢，从而抑制ANAMMOX脱氮性能。醇类对AnAOB有较强的不可逆抑制作用，抗生素和酚类的抑制效果往往是可逆的。

4）典型的AnAOB菌Candidatus Brocadia和Candidatus Jettenia对有机物具有相对较好的适应性。