菌酶添加对喀斯特地区全株青贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响

■ 陆龙超 莫本田 周文章 秦 杨 邓似辰 王清峰 徐龙鑫 武俊达

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550005；3.贵州惠众畜牧科技发展有限公司，贵州黔西 551500）

全株青贮玉米具有生物学产量高、适口性好、储存时间长、养分损失少等特点，是全球重要的草食家畜饲料之一[1]。其有效利用关系到草食动物健康、生产性能和效益，如何促进纤维素有效降解，并控制其青贮过程中营养物质损失是减少饲料浪费、提高饲料利用率、降低成本的有效途径。国内外学者将乳酸菌与纤维素分解菌、纤维素酶等配合青贮饲料[2-17]，通过前期发酵纤维类物质向单糖的转化[4-7]，并控制青贮发酵厌氧条件、能氮平衡、含水量、产酸能力等，提供充足发酵底物促进乳酸发酵，抑制有害菌的生长，提高青贮饲料利用效率[9-10，15]，改善青贮品质以达到提质降耗的目的[18-19]。乳酸菌制剂单独添加及其与纤维素分解菌（cellulose decomposing bacteria，CDB）、纤维素酶（cellulase）联合接种可改善全株青贮玉米发酵品质、营养品质及有氧稳定性，但关于同型乳酸菌、纤维素分解菌、纤维素酶的协同效果较为鲜见；因纤维素酶热稳定性较差，且价格高昂，不适合在生产中推广，纤维素分解菌在青贮发酵中是否可以替代纤维素酶目前尚未明确。本研究拟将CDB 主要包含黑曲霉（Aspergillus niger）+枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、纤维素酶与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, LP）联合接种发酵全株青贮玉米，通过分析青贮饲料发酵特性、微生物含量、营养成分、有氧稳定性，结合模糊数学隶属函数法对青贮营养价值进行综合评价，明确不同添加剂之间协同作用对青贮发酵的影响，探索CDB 替代纤维素酶的作用效果，为喀斯特地区新型青贮菌剂的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

贵州省黔西市金碧镇新兰村贵州畜牧兽医研究所科研示范基地（26°97′ N，105°94′ E，海拔1 200 m），属于亚热带湿润季风气候。全年平均气温为13.8 ℃，最冷月平均气温为3.3 ℃，最热月平均气温为23.0 ℃，年日照时数为1 348.9 h，无霜期为264 d，年平均降水量为1 005.2 mm，黄壤土，pH 7.29，有机质含量适中，速效氮含量丰富，速效磷含量适中，钾、钙、镁、硫、铁含量丰富，适宜作物生长。

1.2 试验材料

全株青贮玉米品种为金玉818（黔审玉2010018号），蜡熟期刈割，留茬高度10～15 cm，经粉碎机切段至1～2 cm，混合均匀后备用。

发酵菌剂，均购于北京中青益草科技有限公司（北京），其中植物乳杆菌菌落总数≥5×1010CFU/g，黑曲霉菌≥1.8×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌≥10×1010CFU/g。纤维素酶（活性≥104U/g），购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（上海）。

1.3 试验设计

全株青贮玉米粉碎后立即采用真空包装袋密封，试验设5个试验组和1个对照组，对照组不添加任何菌剂，试验A 组添加1×105CFU/g 植物乳杆菌，试验B 组添加纤维素分解菌（黑曲霉+枯草芽孢杆菌），试验C组添加0.3%纤维素酶，试验AB组添加1×105CFU/g植物乳杆菌+纤维素分解菌，试验AC 组添加1×105CFU/g植物乳杆菌+0.3%纤维素酶。纤维素分解菌比例为黑曲霉菌∶枯草芽孢杆菌=2∶1，添加量为3.0×105、1.5×105CFU/g。先将粉末菌粉配制成1×1010CFU/mL工作液，再取出相应工作液，定容到100 mL，用灭菌喷壶均匀喷洒于切碎的玉米秸秆，对照组添加等量纯化水，各组具体工作液用量见表1。按照1 000 g/袋装入聚乙烯包装袋，利用食品真空封口机压实抽气封口，每组6个重复，共计36袋，放入避光处模拟自然发酵，青贮第60天取样，测定相关指标。

表1 各试验组工作液添加量

1.4 指标测定

1.4.1 常规营养成分

青贮第60 天开袋解封，均匀取适量样品置于65 ℃烘箱中烘干48 h，粉碎机粉碎过40 目筛保存，待测。干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、粗灰分（Ash）、钙（Ca）、磷（P）按照张丽英[20]编著的《饲料分析及饲料质量检测技术》进行，其中，DM含量采用重量法测定，CP含量采用凯氏定氮法测定，EE采用索氏提取法（乙醚浸出法）测定，使用半自动纤维仪测定NDF 和ADF含量，Ca 含量采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法测定；P含量采用分光光度法测定。

1.4.2 发酵品质

按德国农业协会青贮感官评分标准及等级评定方法[21]，根据气味、结构、色泽三项进行评分，具体评分标准见表2。

表2 青贮饲料感官评分标准（DLG）

取新鲜的青贮饲料20 g 于250 mL 锥形瓶中，加入180 mL去离子水制备浸提液，4 ℃冰箱中浸提24 h，其间用玻璃棒搅拌，用4层脱脂棉纱布过滤，用pH计测定。

有氧稳定性（AS）：将同处理的青贮料两两混合，将青贮料置于塑料袋中混匀，压实，系紧袋口，在青贮料中心插入一根灵敏水银温度计测定温度变化，同时监控室温，从样品接触空气到样品温度高于室温2 ℃的时间（h）即有氧稳定持续的时间。

包括乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）的有机酸采用高效液相色谱仪分析[22]。色谱柱为ZORBAX SB 80 Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为甲醇，流动相B为0.01 mol/L KH2PO4水溶液（用磷酸调pH至2.7），流动相A与流动相B之比为10∶90，使用0.45 μm的纤维素膜过滤，超声波脱气；流速0.7 mL/min；紫外检测波长210 nm；进样量10 μL，柱温50 ℃。

采用苯酚-次氯酸钠比色法[23]测定氨态氮含量。

1.4.3 微生物数量

通过菌体培养乳酸菌（LAB），利用引物设计和qPCR分析法测定微生物数量[24]。

1.5 数据分析

采用SPSS 26.0 软件进行方差分析，所测数据用“平均值±标准差”表示，不同品种间用Duncan’s 多重比较法进行显著性检验，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。采用模糊数学隶属函数法对青贮营养价值进行综合评价，如果测定的指标与青贮的营养价值呈正相关，计算公式如下：

如果为负相关，则用反隶属函数进行转换，计算公式：

U-= 1 -U+

式中：U+——各指标呈正相关隶属函数值；

U-——各指标呈负相关隶属函数值；

x——某样品某指标测定值；

xmax——某样品某指标最大测定值；

xmin——某样品某指标最小测定值。

2 结果与分析

2.1 菌酶添加对发酵全株青贮玉米感官的影响

由表3 可知，各处理全株青贮玉米在结构、色泽上差异不大，仅在气味指标上略有差别，试验组均能够明显闻到微弱香味，对照组则气味较平淡（P<0.05）。各组综合评分均到达一级。

表3 菌酶添加对发酵全株青贮玉米感官影响

2.2 菌酶添加对发酵全株青贮玉米发酵品质和乳酸菌数量的影响

由表4可知，A组pH显著高于对照组和其他试验组（P<0.05）；A、B、C 组LA 含量显著高于对照组（P<0.05），分别较对照组提高23.14%、17.70%和23.95%；试验组AA 含量均高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。PA和BA均未检测出。A、B、C、AB组NH3-N显著高于对照组（P<0.05）。试验各组有氧稳定性时间均显著高于对照组（P<0.05）；AB、AC组LAB 数量显著高于对照组（P<0.05），分别较对照组提高245.21%和197.26%。

表4 菌酶添加对发酵全株青贮玉米发酵品质、有氧稳定性和乳酸菌数量的影响

2.3 菌酶添加对发酵全株青贮玉米营养物质含量的影响

由 表5 可 知，AB 组CP 显 著 高 于 其 他 组（P<0.05），较对照组提高了2.91%，其他试验组CP 均低于对照组；试验各组DM 显著高于对照组（P<0.05）；B、AB 组Ash 显著低于对照组（P<0.05），较对照组降低了5.90%，而C 组显著高于对照组（P<0.05）；A、AC 组EE 显著高于对照组（P<0.05），分别较对照组提高46.94%、46.43%；C、AC 组NDF 显著低于对照组（P<0.05），分别较对照组降低6.64%、6.61%；B、C、AC 组ADF 显著低于对照组（P<0.05），分别较对照组降低9.25%、11.64%、10.08%；A 组Ca显著高于对照组（P<0.05）；A 组P 显著低于对照组（P<0.05）。

表5 菌酶添加对发酵全株青贮玉米营养物质含量的影响(%)

2.4 菌酶添加对全株青贮玉米各指标的综合营养价值影响

利用各项差异性指标进行隶属函数分析，其中CP、DM、EE、LA、AA、EE、Ca、有氧稳定性为正向指标，pH、NH3-N、酵母菌、NDF、ADF、Ash 为负向指标。将青贮玉米以上指标的隶属函数值进行综合营养价值的排序，平均值越大综合营养价值越高，由表6 可知，通过分析可知试验各组的隶属函数平均值都高于对照组，说明添加添加剂后青贮料的综合评价均有不同程度的提高，隶属函数综合营养价值排序从大到小的顺序为AC>C>AB>B>A>对照组。

表6 菌酶添加对发酵全株青贮玉米各指标的综合价值评价

3 讨论

3.1 菌酶添加对发酵全株青贮玉米发酵品质、有氧稳定性和营养价值影响

LP 等同型发酵乳酸菌通过利用葡萄糖产生乳酸，在发酵前期快速降低青贮pH，有效抑制有害菌的生长，以减少蛋白质的降解和乙醇的生成；同时可显著降低干物质损失，提高剩余可溶性碳水化合物含量，进而改善青贮品质[2-3]。CDB 是一类可产生各种纤维素酶的微生物，包括Aspergillus niger、Bacillus subtilis等，均是我国农业农村部认证的安全菌，可产生高活性的纤维素酶、半纤维素酶、酸性蛋白酶、果胶酶等多种胞外酶，两者均为好氧菌，在青贮发酵早期大量繁殖，迅速消耗原料中的氧气，使青贮饲料进入无氧状态，并产生大量分解底物的酶类物质，同时还可以提高青贮温度，从而有效抑制其他好氧腐败菌的生长繁殖[4-5]。纤维素酶是一类可将纤维素分解为寡糖或单糖的蛋白质，增加乳酸菌发酵底物，同时可改变牧草的纤维素结构并降低纤维含量，提高饲料利用率及动物生产性能[7-8,25]。本研究将Aspergillus niger+Bacillus subtilis、纤维素酶与LP 联合接种发酵全株青贮玉米，对试验各组进行感官评价，均达到优良水平，表明试验各组青贮条件较为完好，在结构、色泽上差异不大，仅在气味指标上略有差别，菌酶添加的试验组能够明显闻到乳酸气味，无丁酸气味，对照组则气味较平淡，表明添加单独发酵菌剂、混合发酵菌剂和混合酶菌添加剂发酵全株青贮玉米具有积极的作用。

全株青贮玉米发酵是一个多因素综合调控的复杂生化过程，当外源微生物大量富集成为优势菌群后才能主导发酵。发酵品质由多个指标共同决定，发酵体系的pH、有机酸含量和NH3-N 含量是衡量发酵品质的重要指标。pH 高低可直观反映青贮饲料是否变质，pH 一般为3.8～4.2[8]，本研究除单独添加LP 的pH高于对照组外，其他试验组pH 均与对照组差异不显著，且都在4.2以下，表明在青贮加工过程进行严格的控制，达到了优质青贮料标准。有机酸含量则反映青贮饲料中碳水化合物的转化情况，以往研究在青贮玉米中单独添加LP 或与Bacillus subtilis和纤维素酶联合接种均可降低青贮体系的pH，提高乳酸、乙酸含量[9，26-27]。本研究中LP 与CDB 联合接种时，均提高了乳酸和乙酸含量，值得注意的是，与纤维素酶联合接种时乳酸含量提高的幅度较小，表明CDB的添加并未抑制青贮中植物乳酸菌的产酸能力。NH3-N 反映的是青贮饲料蛋白质的转化情况，青贮过程中多种微生物对底物蛋白质的大量消耗，转化成NH3-N和胺类物质，NH3-N 含量越高，说明CP 和氨基酸分解程度越高，表明青贮饲料的质量不好[10]。本研究中试验各组均较对照组NH3-N 含量提高，这与张凡凡等[5]和吕文龙等[11]研究结果相似，原因可能是厌氧的梭菌未被完全抑制，导致蛋白质被分解[12]。青贮过程中，微生物的种类和数量是影响青贮品质的重要因素，其中关键微生物是乳酸菌，青贮饲料中乳酸菌的数量能直接影响青贮发酵品质好坏，其生命代谢活动是青贮是否成功的重要因素[13,28]。青贮开始时乳酸菌会快速增殖，产生大量乳酸，使得pH 迅速降低，有效抑制有害菌的繁殖，形成良好的青贮环境[29]。本研究中LP 与CDB、纤维素酶、LP 联合接种时提高了青贮发酵60 d 后的乳酸菌数量，表明联合接种时CDB和纤维素酶的添加对乳酸菌的生长具有促进作用，原因可能是CDB和纤维素酶降解纤维素产生单糖，促进乳酸菌的增长。

有氧稳定性是评价青贮饲料品质的重要指标，反映青贮饲料开封后保持新鲜、气味酸香的能力。孙向丽等[30]发现乳酸菌青贮高粱能够显著提高有氧稳定性时间；穆胜龙等[31]研究表明，Bacillus subtilis与LP混合青贮甘蔗尾可改善青贮有氧稳定性，本研究不论是单独添加LP、CDB、纤维素酶亦或是LP与CDB和纤维素酶联合接种的有氧稳定性时间均比对照组高50 h以上，本研究与上述结果一致。有研究发现，乙酸能够有效抑制酵母菌活性，具有抗真菌的作用，从而提高青贮饲料有氧暴露后有氧稳定性的时间[32]，本试验中试验各组的乙酸含量高于对照组，试验各组有氧稳定性时间有效提高。

营养价值是评价青贮玉米饲料优劣的重要指标之一。青贮发酵后DM 含量可反映发酵后底物营养成分的浓度。诸多研究表明，在青贮玉米中添加乳酸菌、CDB 和纤维素酶可显著提高DM 含量[8-9,25,33]。本研究添加LP、CDB、纤维素酶及其联合接种，均较对照组DM 含量提高，可能是由于青贮发酵前底物充足，试验各组添加的菌剂促进了前期的乳酸发酵，加速青贮环境的酸化，进而抑制有害微生物的活性，降低DM的损失。CP 是决定青贮饲料营养价值的重要因素，其蛋白质含量是衡量营养价值的重要指标之一[34]，本研究单独添加LP、CDB、纤维素酶和LP+纤维素酶CP含量较对照组降低，与前人的研究结果一致[8-9，25，35]。原因可能是刈割后植物的呼吸作用、蛋白质降解酶的作用以及微生物代谢活动密切造成；而LP 与CDB 联合接种却提高了CP 含量，与穆胜龙等[31]研究结果一致，表明两者对蛋白质降解具有颉颃作用。原因可能是联合接种产生了竞争性抑制，进而一定程度上抑制了同质性乳酸菌和CDB分解蛋白质的能力，具体原因还有待继续探索。NDF 和ADF 含量是反映反刍动物采食量、瘤胃发酵内环境及其消化率的重要指标[36]。以往研究表明，纤维素酶和乳酸菌制剂联合接种可有效降低青贮玉米NDF 和ADF 含量[6-7，37]。本研究单独添加CDB、纤维素酶以及LP+纤维素酶联合接种得到相同结果，而单独LP和LP+CDB联合接种较不添加处理NDF 含量提高，表明其LP 抑制了CDB 降解纤维的能力，原因可能是抑制CDB 产胞外酶作用所致。EE是提供能量最多的营养成分，也是决定饲料适口性的重要因素。本研究各试验组青贮玉米的EE 含量较对照组提高，原因可能由于菌/酶的作用抑制了脂肪类物质的腐败[5]。

3.2 菌酶添加处理全株青贮玉米各指标的综合价值评价

由于试验组较多，以单一指标评价最佳的试验组是不全面的[38]，因此，将具有差异性的指标进行隶属函数分析，结果表明：不同添加剂发酵全株青贮玉米综合价值排序为：AC>C>AB>B>A>对照组，说明LP与CDB 和纤维素酶联合接种全株青贮玉米综合营养价值优于单独添加LP。虽然添加纤维素酶和LP+纤维素酶综合价值高于LP+CDB，但综合价值评分差距不大，LP+CDB 仅在降解纤维素能力方面较纤维素酶和LP+纤维素酶弱，但纤维素酶成本高昂、热稳定性差，不符合青贮饲料生产实际。因此在本研究中CDB 可一定程度上替代纤维素酶与LP 联合接种全株青贮玉米发酵。但仍需研究不同类型的乳酸菌与CDB 联合接种青贮效果，以更好地提高有效降解纤维素的能力，并在生产实践中进一步验证。

4 结论

LP单独或与CDB和纤维素酶联合接种可有效改善全株青贮玉米的发酵特性和营养品质，提高有氧稳定性，且以LP与纤维素酶联合接种青贮效果最好。CDB可一定程度上替代纤维素酶用于全株青贮玉米发酵。