S-100/CKpan免疫组化双染技术在结直肠癌周围神经侵犯诊断中的应用

张玮琦,陈灿灿

近年我国结直肠癌的发病率和病死率呈逐年上升趋势[1]。在结直肠癌的诊断中,周围神经侵犯与不良预后密切相关,是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素,也是相关病理结果中不可或缺的一环[2]。目前结直肠癌周围神经侵犯的诊断主要依赖病理医师对病理标本HE染色和相应免疫组化结果的判读。本实验将重点介绍一种有助于结直肠癌周围神经侵犯诊断的S-100/CKpan双染技术,该双染技术与传统HE染色结合免疫组化单染法的诊断结果高度一致,且其染色结果更加清晰直观,可于一张玻片内同时呈现多种染色信息。该技术可大幅减少病理医师在阅片过程中寻找并对比不同玻片可疑区域所花费的时间,极大地提升病理医师的诊断效率。该双染技术已在我科通过长期验证并取得极佳效果,现将该技术介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年1月～2022年12月中山大学附属第一医院病理科确诊的存在周围神经侵犯和不存在周围神经侵犯的结直肠癌标本各10例。

1.2 试剂与仪器CKpan(AE1/AE3)(稀释比1 ∶100)一抗试剂购自福州迈新公司;S-100(兔多克隆抗体)一抗购自Dako公司,即用型。免疫组化染色采用罗氏Ventana BenchMark ULTRA全自动免疫组化染色仪,HRP标记二抗试剂盒(OptiView DAB IHC Detection Kit),AP标记二抗试剂盒(Ultra View Universal Alkaline phosphatase Red Detection Kit),染色机配套染色缓冲液等试剂均购自上海罗氏公司。

1.3 制片与染色将选取好的蜡块3 μm厚切片,每个蜡块切片4张,分别用于HE染色、S-100染色、CKpan染色和S-100/CKpan双染。S-100的染色条件:Ultra CC1修复液100 ℃修复24 min,S-100一抗36 ℃孵育24 min,HRP标记的二抗孵育8 min,H2O2与DAB显色8 min,苏木精染色12 min,返蓝液孵育4 min。CKpan的染色条件:Ultra CC1修复液100 ℃修复32 min,CKpan一抗36 ℃孵育32 min,HRP标记的二抗孵育8 min,H2O2和DAB显色8 min,苏木精染色12 min,返蓝液孵育4 min。S-100/CKpan双染的条件:Ultra CC1修复液100 ℃修复64 min,S-100一抗36 ℃孵育32 min,HRP标记的二抗孵育8 min,H2O2和DAB显色8 min,缓冲液冲洗干净后,CKpan一抗36 ℃孵育1 h,AP标记的二抗孵育12 min,增强4 min,Fast Red A/B孵育8 min,苏木精染色12 min,返蓝液孵育4 min。所有染色片染色结束后常规脱水透明,中性树脂封固,镜下观察。

1.4 结果判读由两名主治及以上病理医师独立判读,当肿瘤细胞沿神经纤维方向生长并包绕神经纤维周长33.3%以上,或肿瘤细胞浸润神经纤维的神经鞘进入神经束膜内被判定为周围神经侵犯[3]。两位医师分别反馈染色质量与判读结果,记录并比较HE染色结合S-100、CKpan单染法及S-100/CKpan双染法的判读准确度与判读时间。

2 结果

两名医师独立判读后得出如下结果:按照上述染色条件进行染色,S-100可标记神经纤维束和散在的树突状细胞,阳性定位于细胞核和细胞质,呈中至强阳性染色,CKpan可标记上皮细胞(肿瘤细胞),表达定位于细胞质,呈中至强阳性染色;S-100/CKpan双染时,S-100用DAB显色,呈棕色,CKpan用Fast Red显色,呈红色,两者在镜下可进行有效区分。所有用于对比的切片染色结果清晰,定位准确,均达到优秀的染色标准,可用于疾病的诊断。对比分析发现,使用单一S-100/CKpan双染片的判读结果与传统HE染色结合S-100、CKpan单染的判读结果高度一致;同时,与传统方法相比,S-100/CKpan双染技术可以在同一张切片上更清晰直观地展现肿瘤细胞对周围神经的侵犯程度(图1、2)。更为重要的是,与HE染色结合S-100、CKpan单染方法对周围神经侵犯的判读相比,双染法可以显著提升病理医师的判读效率,特别是在判断微小侵犯或视野内癌细胞分布杂乱等较难判读的情况下该优势尤为明显。通过统计判读时间,结果显示利用双染法诊断时,平均每张玻片可节省约67%的阅片时间(表1)。证明S-100/CKpan双染法在确保诊断结果准确性的同时,也节省了病理医师的阅片、筛片时间。

表1 不同染色方法判读结果和所需时间

图1 结肠腺癌可见周围神经浸润,方框区域为被腺癌浸润的周围神经:A.HE染色结果;B.CKpan免疫组化染色结果,DAB显色,呈棕色;C.S-100免疫组化染色结果,DAB显色,呈棕色;D.S-100/CKpan免疫组化双染结果,S-100用DAB显色,呈棕褐色,CKpan用Fast Red显色,呈红色

3 讨论

周围神经侵犯是影响结直肠癌患者总生存期和预后的独立危险因素。明确患者是否存在周围神经侵犯有助于实现个性化治疗,明确患者术后治疗方案,从而尽可能延长患者的无瘤生存期和总生存期,是结直肠癌病理诊断结果中非常重要的环节[4]。

对于结直肠癌周围神经侵犯的诊断,主要依赖于病理医师对病理标本HE染色片的判读和免疫组化染色技术。利用HE染色并结合S-100、CKpan的单染免疫组化技术可准确判断出是否存在周围神经侵犯,从而满足诊断需求。然而随着病理技术的发展和病理诊断水平的提升,病理取材标准化的推进以及人们整体医疗意识的提高,各医院标本数目与蜡块数量呈逐年增多趋势。在保证阅片质量的同时,也对病理医师的阅片速率提出了新的要求。

免疫组化双染是在同一张玻片上同时显示两种不同抗原的技术,该技术多应用于观察同一组织内两种标记抗体的相互定位关系[5]。与单染技术相比,双染技术不仅可以节省医师的阅片压力,还可有效减少因连续切片或在染色过程中产生的操作误差。但在同一张玻片上进行两种抗体的染色,对技术的要求比单染技术更高,因此在选择抗体双染时,要确保所选用的抗体组合分别定位于不同细胞或同一细胞的不同部位,两者互不干扰。此外,应选择不同颜色显色底物的酶标二抗以区分不同的抗体,同时要注意标记抗体间出现交叉反应等多种问题,以避免染色重叠无法进行观察。

本实验介绍了一种可用于结直肠癌患者周围神经侵犯诊断的S-100/CKpan双染技术,该方法与HE染色配合S-100、CKpan单染的诊断结果高度一致,且其染色结果清晰直观,红色与棕褐色染色在蓝色背景下对比明显,极易发现受侵犯的周围神经。同时,该方法将两种免疫组化染色结果同时呈现在同一张玻片上,减少了切片数量和对比的误差,同时也可节省病理医师耗费在找片、对比分析不同玻片和观察的时间,从而大幅提升医师的诊断效率。此外,由于在同一张玻片上染色两种抗体,可在一定程度上节省患者组织、技术人员工作量和自动染色机的损耗,进而节省成本,该技术值得在日常工作中大力推广。