基于网络药理学和分子对接的半枝莲二萜类化合物抗肝癌作用机制

严绪华，梅格格，梅凌，方振峰

作者单位：1武汉市中医医院综合药学部，湖北 武汉 430010；2江汉大学医学院药学系，湖北 武汉 430056

原发性肝癌，简称为“肝癌”，因其具有较高的发病率和病死率，已成为我国最常见恶性肿瘤之一［1］。从病理学类型上肝癌可划分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝细胞癌-胆管癌（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA），三者差异较大，其中HCC 占75%～85%，在我国肝癌病人中比较常见［2］。目前，对肝癌的治疗普遍存在复发概率高、手术困难、肝源缺乏、预后较差等问题［3］。中医药作为我国传统医学已存在几千年，其在肿瘤治疗方面有自己独特之处。现代药理发现部分中药可通过抑制癌细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导癌细胞凋亡、提高免疫力和调节信息通路等来达到预防或治疗肝癌的目的［4］。因此，从传统中药中寻找抗癌活性成分引起了科研工作者的广泛兴趣［5-10］。

半枝莲，民间又称为狭叶韩信草（广州植物志），水韩信（广西药用植物图志）等［11］，为唇形科（Labiatae）植物半枝莲Scutellaria barbataD.Don的干燥全草，多年生草本植物，常见于田边沟渠或湿润的草地，国内主产于河北、山东、陕西南部、河南、江苏、浙江等地区［12］。半枝莲作为一种常见的抗癌作用的中药，其单味药或复方用药常用于治疗胃癌、乳腺癌、肝癌等［10-11，13］。半枝莲在抗肿瘤方面的研究主要集中在黄酮类成分［14-17］以及多糖类成分［18-20］，但近几年，人们陆续发现其二萜类成分（包括二萜生物碱类）也具有较好的抗肿瘤作用［21］，这引起了人们对半枝莲中二萜类化合物的兴趣。在前期研究中，本团队发现半枝莲生物碱富集部分（主要为二萜及二萜生物碱类化合物）表现出较明显的抗HepG2 肝癌细胞毒活性［22］，同时，严威［23］报道了5 个半枝莲二萜类化合物能逆转肿瘤细胞HepG2/ADR（阿霉素耐药株）多药耐药活性。但目前对半枝莲二萜类化合物抗肝癌作用机制未见文献报道。有鉴于此，本研究拟采用网络药理学和分子对接联用的方法探讨半枝莲二萜类化合物抗肝癌可能的潜在靶点和通路，为进一步深入研究二萜类化合物抗肝癌相关作用机制提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 半枝莲二萜活性成分的筛选利用scifinder数据库，以“Scutellaria barbata”为关键词进行主题搜索（1987 年1 月至2022 年7 月），从所检索出的文献中获取半枝莲二萜类化合物（包含二萜生物碱类化合物）。使用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）对所得化合物进行确认，对于未收录的化合物用ChenDraw 进行绘制，所有化合物结构均以sdf 格式文件保存。利用SwissADME 数据库［24］（http：//www.swissadme.ch/）预测化合物的生物利用度及类药性。设定胃肠道吸收为“高”结果作为药物可以被吸收的条件，用于筛选具有较好口服生物利用度的活性化合物；设定5 种类药性（ Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge） 预结果中有2 个及2 个以上为“是”的化合物，即可作为活性化合物。

1.2 半枝莲二萜活性成分靶点的预测在Swiss 靶点预测数据库［25］（http：//www.swisstargetprediction.ch）中依次导入sdf格式的半枝莲二萜活性化合物结构，进行靶点预测。物种参数设置为“智人”，以可能性（Probability）大于0 为条件，得到相关的靶点信息。选择每个活性化合物可能性最高的20 个预测靶点，删除重复。再利用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/uploadlists/），设置物种为“human”，将预测的靶标蛋白名称转换为所对应的基因名。

1.3 肝癌疾病靶点的获取利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https：//omim.org/）、PharmGKB 数据库（https：//www.pharmgkb.org/）、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com/）、The Cancer Genome Atlas（TGCA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“liver cancer”“HCC”为关键词筛选疾病靶点，设置物种为“智人”，将7个数据库获得的结果进行整理，并去掉重复靶点，得到最终疾病靶点。

1.4 半枝莲二萜“活性成分-抗肝癌靶点”网络构建利用在线作图工具VENNY 2.1（http：//www.liuxiaoyuyuan.cn/）对半枝莲二萜活性成分预测靶点和肝癌疾病靶点取交集，得到半枝莲二萜治疗肝癌的潜在作用靶点。将半枝莲二萜活性成分和交集靶点分别导入Cytoscape 3.7.2 软件［26］，构建半枝莲二萜“活性成分-抗肝癌靶点”可视化网络，并进行美化。根据度值筛选出核心半枝莲二萜活性化合物。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图的构建及核心靶点的筛选将“1.4”项中得到的半枝莲二萜治疗肝癌的潜在作用靶点导入String 数据库（https：//www.string-db.org/），物种设定为“智人”，将最低相互作用分值设为 “highest confidence（0.900）”，在“网络显示选项”里选择隐藏没有相互作用联系的节点，其他参数设置保持不变，得到PPI关系，导出相应的相互关系数据文件到 Cytoscape中进行可视化分析并进行美化；利用cytoHubba 插件筛选出评分前10 的核心靶点，绘制核心靶点的可视化网络图。

1.6 基因本体（GO）富集分析和KEGG 通路分析利用R 语言将核心靶点基因转换成基因ID，并利用相应的软件包对基因进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，将P＜0.05作为筛选标准。

1.7 分子对接将筛选出的半枝莲二萜活性化合物用ChemDraw 软件绘制成3D 结构，同时在PDB 蛋白质结构数据库（https：//www.pdbus.org/）中找出筛选出的关键靶点相对应的靶点蛋白晶体结构，并用Pymol 软件将蛋白晶体进行处理，分离出各自的原始配体。使用Autodock Tool 软件对活性成分、靶点蛋白晶体结构、原始配体进行处理，各自保存为pdbqt 格式；找出靶点蛋白和原始配体的“grid box”，作为活性口袋，并进行原始配体对接验证。使用Autodock Vina 1.1.2［27］进行靶蛋白和活性成分之间的对接，选取合适的构象，使用Pymol 软件对各关键靶点对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 半枝莲二萜活性成分的筛选通过Scifinder数据库进行文献检索，共获得155 个半枝莲二萜类化合物（表1）。利用SwissADME 数据库进行化合物的生物利用度及类药性预测，同时取胃肠道吸收为“高”作为药物可被吸收的条件，共获得符合条件的93个半枝莲二萜类化合物。

表1 半枝莲二萜类化合物SwissADME及SwissTargetPrediction 筛选结果

2.2 半枝莲二萜活性成分靶点的预测将上述符合生物利用度及类药性预测的半枝莲二萜类化合物分别导入SwissTargetPrediction 数据库预测活性成分的靶点，根据靶点预测的可能性（大于0），最终得到65 个活性化合物（见表1），取每个活性化合物预测可能性最高的20 个靶点，删除重复，最终得到363个基因靶点。

2.3 肝癌疾病靶点获取结果在7 个数据库中依据关键词筛选疾病靶点，其中GeneCards 数据库16 804 个、OMIM 数据库173 个、PharmGKB 数据库295 个、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 数据库14个、DrugBank 数据库193 个、TCGA 数据库17 439个、GEO 数据库（GEO 登录号：GSE84402）差异基因1 242个，整理后去掉重复靶点后得到20 546个疾病靶点。

2.4 “活性成分-靶点-肝癌”网络构建利用在线作图工具对半枝莲二萜活性成分的363个预测靶点和肝癌疾病的20 546 个靶点取交集，绘制Venn 图，得到潜在作用靶点360 个。将交集靶点和65 个半枝莲二萜活性成分导入cytoscape 软件，构建“活性成分-靶点-肝癌”网络图（图1），包括426 个节点和1734 条边。度值越大，节点越大，选取其中度值排名前5 的化合物作为半枝莲二萜主要活性成分，分别为Scutebarbolide I（度值28）、Scutellone F（度值25）、Scutellone H（度值25）、Scutelinquanine D（度值25）、Scutebarbatine J（度值24）和Scutebata O（度值24）。

图1 半枝莲二萜“活性成分-靶点-肝癌”网络

2.5 PPI 网络图的构建及核心靶点的筛选将半枝莲二萜治疗肝癌的360 个潜在作用靶点导入String 数据库，得到蛋白相互作用图。将数据导出后用cytoscape进行相应处理，得到PPI网络图（图2），包括264 个节点，981 条边，其中度值越大，节点越大，颜色也越深；连接评分越高，边越粗，颜色也越深。利用cytoHubba 插件进行核心靶点的筛选，设置为以“Degree”值（度值）进行评价，得到评分排名前10 的靶点（表2），同时得到核心靶点的PPI 网络可视图（图3），包括10 个节点，27 条边，其中靶点颜色越深表示其越重要。从PPI 图中可以看出，STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 这6 个蛋白在网络中与其他靶点的相关性更明显，关联更密切，可能是半枝莲二萜治疗肝癌的关键靶点。同时，我们发现在关键疾病靶点和“2.4”项所得核心化合物之间直接关系不明显，仅Scutelinquanine D 与MARPK1，Scutebarbatine J 与MARPK1、PIK3CA 有直接关系，因此，还需要通过分子对接来预测关键靶点和核心化合物之间的是否有相互作用。

图2 半枝莲二萜治疗肝癌的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图

图3 半枝莲二萜治疗肝癌的核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）图

表2 半枝莲二萜治疗肝癌的核心靶点

2.6 GO 富集分析和KEGG 通路分析对筛选出的10个核心靶点进行GO富集分析，共获得953条P＜0.05 的GO 功能条目，其中766 条涉及生物过程、45条涉及细胞成分、142 条涉及分子功能，各选取排名前10 的条目绘制GO 功能气泡分析图，见图4。从图中可以看出，生物过程主要涉及肽基-丝氨酸磷酸化、肽基-丝氨酸修饰、DNA 代谢过程的调节、蛋白质输入、DNA 代谢过程的正调控、细胞内转运的调节、细胞对化学应激的反应、镉离子响应、细胞器遗传、高尔基遗传等过程；细胞成分主要涉及囊腔、无花果素-1-富含颗粒管腔、无花果素-1-富含颗粒、转移酶复合物等；分子功能主要涉及磷酸酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶结合、蛋白丝氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶结合等。

图4 半枝莲二萜治疗肝癌核心靶点基因本体（GO）富集分析（前10）

对筛选出的10 个核心靶点进行KEGG 通路分析，设置P＜0.05，共获得137 条富集通路，按照P值小且基因靶点数较多的原则筛选出前20条通路，并对其做通路富集气泡图，见图5，包括癌症中蛋白多糖、化学致癌受体激活、催乳素信号通路、癌症程序性死亡受体配体1（PD-L1）表达和程序性死亡受体1（PD-1）检查点通路、内分泌抵抗、孕酮-介导卵母细胞成熟、FoxO 信号通路、雌激素信号通路、脂质与动脉粥样硬化、人巨细胞病毒感染、冠状病毒病-新型冠状病毒感染（COVID-19）、胰腺癌、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂抵抗等。

图5 半枝莲二萜治疗肝癌的京都基因和基因组数据库（KEGG）通路富集分析

2.7 分子对接分子对接结果（表3）显示，除了Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 与PIK3R1 结合能大于-20.9 kJ/mol 外，核心活性化合物Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 与关键靶点的最低结合能均低于-20.9 kJ/mol，表明核心活性化合物能与关键靶点有良好的结合力［28］，其中Scutebata O、Scutelinquanine D 与MAPK1 结合能强于其特异性配体CQ8，Scutebata O、Scutelinquanine D 与PIK3CA 结合能强于其特异性配体VBS，Scutebarbolide I 与MAPK3 结合能强于其特异性配体5ID。以上结果表明活性成分与关键靶点具有较强的结合活性，尤其与MAPK1 和PIK3CA 两靶点结合活性更强。化合物与靶点之间的相互作用见图6，从图中可知，MAPK1 主要是通过残基ASP-104、ASN-152、SER-151、MET-106 中羰基以及ASP-109、ALA-33 中O 或N 原子与配体活泼H 之间形成氢键相结合；MAPK3 主要通过残基ASP-184 中羰基以及CYS-183 中巯基与化合物Scutebarbolide I 中活泼氢形成氢键相结合；而PIK3CA主要通过残基GLU-849中羰基和配体活泼氢形成氢键以及残基SER-854中羟基氢与配体中羰基形成氢键相结合。

图6 半枝莲二萜主要活性化合物与关键靶点的分子对接

表3 半枝莲二萜关键靶点和活性成分的分子对接结果

3 讨论

肝癌是临床上常见的一种恶性肿瘤疾病，可由多种病因造成，其中肝炎病毒的感染、化学致癌物质是形成肝癌的主要诱因［29-30］。近些年，许多中药在治疗肝癌过程中疗效明确，毒副作用较少，能有效地缓解肝癌相关并发症，且能有效抑制肝癌细胞转移，降低术后复发率［10］。半枝莲作为传统抗肿瘤中药，在临床上对肝癌有较好的疗效［31-32］。近几年，半枝莲二萜类化合物，包括二萜生物碱类化合物对抗肝癌细胞毒活性的引起了人们的关注［22-23，33］，但其作用机制未见文献报道。

本研究通过对半枝莲相关研究文献的检索，得到半枝莲二萜类化合物，并通过SwissADME 数据库和Swiss 靶点预测数据库筛选得到活性化合物65个，同时得到活性成分的预测靶点363个；其与疾病靶点交集得到的360 个潜在靶点，经过PPI 网络分析，筛选得到10 个核心靶点，其中STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 为度值最高的6个靶点，它们和其他靶点的关联性明显，可能为半枝莲二萜治疗肝癌的关键靶点。研究表明，STAT3 是一种关键的致癌转录因子，也是癌症治疗的有吸引力的靶标［34］。STAT3 参与肝癌细胞的增殖、侵袭与转移，也促进肝癌细胞抗凋亡及免疫逃逸，是传染性病原体诱发肝癌发生的炎症介质，能促进肝癌细胞上皮-间质转化［35］。MAPK1（又名细胞外调节蛋白激酶2，ERK2）和MAPK3（又名细胞外调节蛋白激酶1，ERK1）为MAPK 家族中ERK 成员。肝炎病人的肝内细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、炎症趋化因子等表达增加，会激活ERK 信号通路，使肝细胞异常增殖，诱发肝癌［36］。另外，有研究表明ERKl 可能是耐药基因表达的上游调控元件，从而作为逆转肝癌耐药性的分子靶点［37］。有研究表明，HSP90AA1 在丙型肝炎病毒（HCV）诱导的HCC中表现为过表达，可以作为检测此类HCC 进展的生物标志物［38］。PIK3R1（即P85 或P85-α）和PIK3CA［即磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-α 或P110-α］为PI3K家族中最经典的IAPI3K。有研究证实，PI3K 的p85调节亚基在肝脏中起到生长因子信号传导抑制剂和新型肿瘤抑制因子的作用，增加或恢复p85 的表达可能代表一种潜在癌症治疗可能性［39］；PIK3CA通过激活下游的蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路诱导肝癌的发生，因此，抑制PI3K/AKT/mTOR 通路可能成为肝癌治疗的一个有效方法［40］。半枝莲二萜类成分可能是通过对上述多个靶点的信号调控达到治疗肝癌的作用。

血管内皮生长因子受体（VEGFR）包含VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 三种亚型，其中VEGFR-2 直接参与血管生成，介导内皮细胞的生长和渗透，与肿瘤的增殖、侵袭性有关［41］。癌症中蛋白多糖主要影响肿瘤细胞生长因子的信号传导和增殖作用。化学致癌物质是导致肝癌的重要因素，部分化学物质通过与DNA 发生反应改变遗传信息从而在致癌过程中起启动的作用，部分通过增加细胞增殖而增加癌症风险［42］。肿瘤细胞通过调节PD-L1 的表达，能和PD-1 受体相结合，并进一步激活T 细胞凋亡，从而通过抑制CD8+T 和CD4+T 细胞的活化开启逃避宿主细胞免疫监视的功能［43］。人巨细胞病毒（CMV）初次感染人体后终身潜伏体内，CMV 影响细胞的信号传送和增殖的调控而诱导原癌基因的表达，使肝癌病人免疫功能降低而致使体内潜伏感染的被激活而引起增殖性感染，增加了死亡风险［44］。GO 富集分析表明，半枝莲二萜成分通过肽基-丝氨酸磷酸化、肽基-丝氨酸修饰、DNA 代谢过程的调节、蛋白质输入、DNA 代谢过程的正调控、细胞内转运的调节、细胞对化学应激的反应、镉离子响应等生物过程，囊腔、无花果素-1-富含颗粒管腔、无花果素-1-富含颗粒、转移酶复合物等细胞组成，磷酸酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶结合、蛋白丝氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶结合等分子功能治疗肝癌。KEGG 通路富集结果表明半枝莲二萜成分通过癌症中蛋白多糖、化学致癌受体激活、催乳素信号通路、癌症PD-L1 表达和PD-1 检查点通路、内分泌抵抗、孕酮-介导卵母细胞成熟、FoxO 信号通路、雌激素信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抵抗等信号通路治疗肝癌。

分子对接结果显示，半枝莲二萜成分中度值排名前5的活性成分Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 与核心靶点STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 有较好的结合位点，最低结合能在-17.6～-38.1 kJ/mol，主要以氢键结合力为主。其中化合物Scutebarbolide I、Scutelinquanine D、Scutebata O 和Scutebarbatine J 为二萜生物碱类化合物，和靶点MAPK1、PIK3CA 结合力最好，部分化合物的最低结合能甚至超过靶点的特异性配体的最低结合能，提示半枝莲二萜生物碱类化合物可能在半枝莲二萜治疗肝癌中具有重要的地位，其作用可能和对MAPK1、PIK3CA靶点的调控有关。

综上所述，本研究采用网络药理学结合分子对接技术探究了半枝莲二萜类化合物治疗肝癌的物质基础和作用机制，表明半枝莲二萜类化合物治疗肝癌具有多成分、多靶点、多通路、多机制的特点，同时也表明半枝莲二萜生物碱类化合物在肝癌的治疗中可能具有潜在的价值，为半枝莲治疗肝癌的深入研究提供理论基础和科学依据。

（本文图1～3见插图3-3，图4～6见插图3-4）