洛索洛芬钠含量测定方法学研究

蒋晓勤 陈雨蕉 付金凤

洛索洛芬钠化学名为2-[4-（2-氧代环戊基甲基）苯基]丙酸钠二水合物，为苯丙酸类非甾体消炎药，于1986 年在日本上市。洛索洛芬钠具有较好的镇痛消炎解热作用，镇痛作用较强，应用范围较广，目前已广泛应用于骨性关节炎[1-3]、强直性脊柱炎[4]、肩周炎[5]、拔牙后的疼痛[6]等。

洛索洛芬钠目前的主要剂型有片剂、胶囊、分散片、颗粒剂和贴剂，溶出度、含量均匀度及含量测定检测方法主要有紫外分光光度法[7]和高效液相色谱法[8]。笔者对市售的11 个厂家的多个批次的片剂和胶囊剂进行检测，经过比较发现，不同厂家的溶出度、含量均匀度和含量测定方法均不相同，流动相比例、稀释溶剂等不同。因此笔者开发了一种合适的检测方法，可用于洛索洛芬钠原料药含量测定，片剂及胶囊溶出度、含量均匀度及含量测定等项目分析，并对其进行了方法学验证。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂与对照品 洛索洛芬钠：中国食品药品检定研究院，批号：100638-202104，含量：87.5%；甲醇：色谱纯，Fisher Chemical，批号：218273；冰醋酸，国药集团化学试剂有限公司，批号：20230509；三乙胺，国药集团化学试剂有限公司，批号：20190909；色谱柱：Shim-Nex CS C18（4.6×150 mm，5 μm）（色谱柱1）；Xbridge®Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm）（色谱柱2）；Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm）（色谱柱3）。

1.1.2 仪器 电子天平：METTLER TOLEDO XP205、METTLER TOLEDO XPE205；高效液相色谱仪：岛津LC-20AD，赛默飞UltiMate 3000，Waters e2695。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如Shim-Nex CS C18（4.6×150 mm，5 μm））；流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（600∶400∶1∶1）；检测波长：222 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；稀释溶剂：水。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 标准曲线溶液的配制 对照品储备溶液的制备：取洛索洛芬钠对照品约69 mg，置100 ml 量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀（600 μg/ml）。

标准曲线溶液1～6 的制备：精密量取对照品储备溶液5 ml、3.5 ml、4 ml、5 ml、6 ml、6.5 ml，分别置100 ml、50 ml、50 ml、50 ml、50 ml、50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。标曲1：30 μg/ml，50%含量测定浓度；标曲2：42 μg/ml，70%含量测定浓度；标曲3：48 μg/ml，80%含量测定浓度；标曲4：60 μg/ml，100%含量测定浓度；标曲5：72 μg/ml，120%含量测定浓度；标曲6：78 μg/ml，130%含量测定浓度。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 取洛索洛芬钠对照品约14 mg，精密称定，置200 ml 量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，加水稀释至刻度，摇匀。

1.2.2.3 供试品溶液的制备 取本品20 片，精密称定，研细，精密称取约1 片量（约相当于洛索洛芬钠60 mg），置100 ml 量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，平行制备6 份。

1.2.2.4 系统适用性溶液的制备 取洛索洛芬钠约12.5 mg，精密称定，置50 ml 量瓶中，加4 mol/L 盐酸溶液5 ml，98 ℃水浴加热0.5 h，加4 mol/L 氢氧化钠溶液中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

1.2.2.5 加标回收率溶液的制备 低、中、高浓度加标回收率溶液的制备（80%含量测定浓度）：取生产企业A 提供的空白辅料约0.25 g，置100 ml 量瓶中，分别取洛索洛芬钠对照品约55 mg、69 mg、82 mg置上述容量瓶中，混匀，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。精密量取续滤液 5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，每个浓度平行制备3 份。

1.2.2.6 专属性溶液的制备 空白辅料溶液的制备（生产企业A）：取生产企业A 提供的空白辅料约0.25 g，置100 ml 量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

空白辅料溶液的制备（生产企业B）：取生产企业B 提供的空白辅料约0.25 g，置100 ml 量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

空白胶囊壳溶液的制备（生产企业C）：取生产企业C 的洛索洛芬钠胶囊空白胶囊壳1 粒，置100 ml量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

空白胶囊壳溶液的制备（生产企业D）：取生产企业D 的洛索洛芬钠胶囊空白胶囊壳1 粒，置100 ml量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

空白胶囊壳溶液的制备（生产企业E）：取生产企业E 的洛索洛芬钠胶囊空白胶囊壳1 粒，置100 ml量瓶中，加水适量，超声使洛索洛芬钠溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

2 结果

2.1 专属性

取稀释溶剂、空白辅料溶液（生产企业A）、空白辅料溶液（生产企业B）、空白胶囊壳溶液（生产企业C）、空白胶囊壳溶液（生产企业D）、空白胶囊壳溶液（生产企业E）、对照品溶液、系统适用性溶液分别按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图。

稀释溶剂、空白辅料溶液（生产企业A）、空白辅料溶液（生产企业B）、空白胶囊壳溶液（生产企业C）、空白胶囊壳溶液（生产企业D）、空白胶囊壳溶液（生产企业E）在洛索洛芬钠出峰处均无干扰峰；洛索洛芬钠对照品溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，理论塔板数按洛索洛芬钠峰计为7 840（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为6.1、14.1，完全分离，符合规定。见图1～8。

图1 稀释溶剂色谱

图2 空白辅料溶液（生产企业A）色谱

图3 空白辅料溶液（生产企业B）色谱

图4 空白胶囊壳溶液（生产企业C）色谱

图5 空白胶囊壳溶液（生产企业D）色谱

图6 空白胶囊壳溶液（生产企业E）色谱

图7 洛索洛芬钠对照品溶液色谱

图8 系统适用性溶液色谱

2.2 精密度

2.2.1 重复性 取对照品溶液、供试品溶液分别按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。6 份供试品溶液含量的相对标准偏差（RSD）为0.4%，小于1.0%（《中华人民共和国药典》2020 年版四部9101 分析方法验证指导原则），符合规定。

2.2.2 中间精密度 由实验人员1、实验人员2 和实验人员3 分别于2 d 按“对照品溶液的制备”及“供试品溶液的制备”方法制备溶液，并按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。18 份供试品溶液平均含量为98.53%，RSD 为0.5%，小于2.0%（《中华人民共和国药典》2020 年版四部9101 分析方法验证指导原则），符合规定。

2.3 范围及线性

取标准曲线溶液1～6 分别按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，以对照品峰面积A作为Y轴，以浓度C作为X轴建立线性回归方程，结果如下。A=2.554 13e-5C+0.0161 819，r=0.999 99。结果表明：洛索洛芬钠在30～78 μg/ml 的范围内线性关系良好，均符合要求。

2.4 检测限及定量限

检测限溶液的制备：精密量取标准曲线溶液4溶液4 ml，置 50 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液5 ml，置20 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.012 μg/ml 的溶液。

定量限溶液的制备：精密量取标准曲线溶液4溶液4 ml，置50 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.048 μg/ml 的溶液。

取检测限溶液与定量限溶液，分别按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，计算信噪比。

结果表明定量限为0.048 μg/ml，洛索洛芬钠的信噪比为10.27；检测限为0.012 μg/ml，洛索洛芬钠的信噪比为5.51，满足检测要求。

2.5 准确度（加标回收率）

取低浓度加标回收率溶液、中浓度加标回收率溶液、高浓度加标回收率溶液分别按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。低、中、高浓度加标回收率溶液的加标回收率依次为100.73%、100.49%、100.50%、100.29%、100.81%、100.33%、100.25%、100.58%、100.31%，均在98%～101%范围内（《中华人民共和国药典》2020 年版四部 9101 分析方法验证指导原则），符合规定。

2.6 耐用性

2.6.1 柱温耐用性

2.6.1.1 柱温为30 ℃ 将柱温改为30 ℃，其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

课题组归纳出一些具体的学生创新学习方法，如自主学习、问题学习、开放学习、案例学习、课题学习和网络学习等方法[3]，增强学生探究和体验的机会。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为7 531（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为6.3、14.5，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.03%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.4%，符合规定。

2.6.1.2 柱温为40 ℃ 将柱温改为40 ℃，其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为7 809（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为5.7、14.0，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.02%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.4%，符合规定。

2.6.2 流动相耐用性

2.6.2.1 流动相为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（55∶45∶1∶1） 将流动相改为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（55∶45∶1∶1），其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为8 610（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为7.9、22.7，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.05%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.4%，符合规定。

2.6.2.2 流动相为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（65∶35∶1∶1） 将流动相改为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（65∶35∶1∶1），其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为7 004（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为3.9、6.2，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.06%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.5%，符合规定。

2.6.3 色谱柱耐用性

2.6.3.1 Xbridge®Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm） 将色谱柱改为Xbridge®Shield RP18（4.6×250 mm，5 μm），其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为10 845（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为2.2、12.5，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.10%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD为0.4%，符合规定。

2.6.3.2 Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm） 将色谱柱改为Inertsil ODS 3 C18（4.6×250 mm，5 μm），其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为11 173（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度依次为7.1、20.6，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.04%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.4%，符合规定。

2.6.4 仪器耐用性2.6.4.1 赛默飞UltiMate 3000 将高效液相色谱仪改为赛默飞UltiMate 3000，其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为9 795（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度为7.3，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.07%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.5%，符合规定。

2.6.4.2 Waters e2695 将高效液相色谱仪改为Waters e2695，其他色谱条件不变，依次取系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，按外标法计算含量。

对照品溶液中洛索洛芬钠峰理论塔板数为7 418（应不低于5 000）；系统适用性溶液色谱图中洛索洛芬钠峰形良好，与相邻杂质峰分离度为5.3，完全分离；对照品溶液连续进样5 针，RSD 为0.5%，符合规定。6 份供试品溶液含量RSD 为0.4%，符合规定。

2.7 对照品溶液稳定性

依次于0、24、48、96、120、144 h 取对照品溶液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，计算f值。对照品溶液24、48、96、120、144 h 的f值与0 h 的f值比值均在0.98～1.02 范围内，表明对照品溶液在144 h 内稳定。见表1。

表1 溶液稳定性实验结果

2.8 膜过滤实验

取供试品溶液10 ml，过滤，依次取初滤液、弃去2 ml 滤液、弃去4 ml 滤液、弃去6 ml 滤液、弃去8 ml 滤液按“1.2.1”项下色谱条件进样，采集色谱图，比较峰面积变化。

较初滤液中洛索洛芬钠峰面积，弃去2 ml 滤液、弃去4 ml 滤液、弃去6 ml 滤液、弃去8 ml 滤液中洛索洛芬钠峰面积均未明显降低，表明洛索洛芬钠无明显膜吸附作用。

3 讨论

3.1 关于溶剂的选择

综合查阅文献资料及洛索洛芬钠自身的性质，可以考虑水和流动相作为溶解溶剂，笔者比较了市售多个厂家洛索洛芬钠片、洛索洛芬钠胶囊分别采用水及流动相溶解制样后的含量（双样本双平行，对照品溶解同供试品），结果表明采用水及流动相溶解的对照品f值无明显差异，采用水及流动相溶解的供试品含量无明显差异。基于上述两点原因，笔者选择更环保且易得的水作为溶解溶剂。

3.2 关于系统适用性

笔者在“1.2.1”项色谱条件下测试了多个洛索洛芬钠中的已知杂质，上述杂质在此条件下均可以与洛索洛芬钠完全分离（杂质之间无法完全分离）。同时，笔者也分析了多个厂家洛索洛芬钠原料药，其杂质含量均较低。因此，笔者未设置分离度系统适用性条件。

该方法范围及线性，精密度，准确度，耐用性等均良好，适用于洛索洛芬钠原料药含量测定，洛索洛芬钠片及胶囊溶出度、含量均匀度及含量测定等项目分析。