巴戟天多糖对大鼠骨质疏松的作用机制研究

张民珍,罗 文,杨黎艳,邝慧芳

(海南医学院第一附属医院,海南 海口 570102)

骨质疏松(Osteoporosis,OP)是以低骨质量和骨组织细微结构遭破坏为临床表现的全身性疾病[1]。OP具有较高的发病率、复发率,降低患者生活质量[2]。中医学并无OP病名,医学古代经典文献中有相仿症状的病症记载,例如“骨痿”“骨枯”等。中医认为,肾精充足则“齿更发长”,肾精的盛衰关乎骨的生长、发育、强弱,骨骼强健有力,肾精亏损,骨骼失养,产生骨病。中药巴戟天用来健骨保肾、消肿止痛,治疗骨质疏松、股骨头坏死等骨科疾病。巴戟天为双子叶属茜草科植物,又名鸡眼藤、三角藤、鸡肠风等,张景岳在《景岳全书》中记载:“虽曰足少阴肾经之药,然亦能养心神,安五脏,补五劳,益志气,助精强阴。治阴痿不起,腰膝疼痛及夜梦鬼交,遗精尿池,小腹阴中相引疼痛等证”。陶弘景在《名医别录》中谓其具有“头面游风,小腹及阴中相引痛,下气,补五劳,益精,利男子”。现代中药学总结了前人的记录,巴戟天其味甘、辛,性微温,归肾、肝经,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效,用于阳痿遗精、月经不调、宫冷不孕、少腹冷痛、筋骨痿软、风湿痹痛。近年来,中医在OP治疗中呈现显著优势,OP发病机制复杂,体内环境、作息规律、新陈代谢水平及基因遗传等因素都可能引发OP[3]。巴戟天多糖为巴戟天的有效活性成分,临床试验及动物模型均证实,其改善骨质量作用明显,且不良反应轻微[4-5]。因OP患者的骨密度和骨质量下降,增加了骨折风险,骨折并发症多发生在50岁以上人群中,男女分别占比1/3、1/5,严重影响患者健康状态。口腔中的废用残根会吸收剩余牙槽骨,降低剩余牙槽骨形态,因长久缺少咀嚼力刺激,骨小梁密度降低、疏松,骨髓间隙变大,弱化甚至丧失咀嚼功能。钙结合蛋白-D9k(Calbindin-D9k,CaBp-D9k)是一种与肠道中钙具有高度贴合性的细胞内蛋白质,主要集中在杯状细胞与小肠刷状缘的吸收细胞中,参与小肠钙细胞内转运过程,受活性维生素D调节[6]。骨生物力学将骨强度和抗骨折能力通过指标检测直接反映出来,具有评价骨骼特性和抗OP药物疗效作用。本文主要研究巴戟天多糖对OP大鼠废用残根咀嚼功能、CaBp-D9k、骨生物力学的作用机制,为相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:30只SPF级SD雌性大鼠,鼠龄4～6周,平均体重(220±20)g,由河北医科大学动物实验中心提供,大鼠[合格证号708068、许可证号SCXK(冀)2018-2-017],大鼠于海南医学院实验动物中心饲养,平均温度(24±2)℃,湿度50%～80%,12 h昼夜交替,正常饮食及摄水,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.1.2 实验药物:干燥巴戟天根茎购自美国 Signal Chemical公司,用10倍温水浸泡1 h后于75 ℃下热煎,冷却得到巴戟天浸膏,加入95%乙醇,配比为1∶4,置于2 ℃冰箱沉淀,经离心得巴戟天多糖,经低压冻干、去蛋白、膜滤过及凝胶柱分离程序得到白色粉末状巴戟天多糖成品,浓度2.0 g/ml溶液,4 ℃密封保存备用,结构分析由海南医学院中心实验室完成。

1.1.3 实验试剂:TNF-α试剂盒(货号ml002953,上海酶联生物科技有限公司);IL-6试剂盒(货号ml102828,上海酶联生物科技有限公司);ALP试剂盒(货号ml092964,上海酶联生物科技有限公司);CaBp-D9k一抗(货号D9K12-S,北京达科为生物技术有限公司);钙结合蛋白-D28k(Calbindin-D28k,CaBp-D28k)一抗(货号PRO-400,上海淳麦生物科技有限公司);二抗IgG[货号A21020-1,亚科因(武汉)生物技术有限公司];GAPDH(批号C1319-100,北京普利莱基因技术有限公司)。

1.1.4 实验仪器:高速离心机(型号GDR525C,深圳市三莉科技有限公司);双能X线扫描骨密度仪(型号Dexa Pro-L,徐州品源电子科技有限公司);酶标分析仪(型号RT-6100,Rayto公司);三点弯曲实验机(型号 shqx,上海企想检测仪器有限公司);显微CT(型号nanoVoxel-1000,天津三英精密仪器股份有限公司);免疫分析仪(型号UNION-A,深圳市亚辉龙生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立:对参与实验的大鼠常规饲养,除正常组外,其余均建立OP大鼠模型。用110 mg/kg苯巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射麻醉,麻醉完成后将大鼠固定于动物手术台,常规消毒后从大鼠腰背侧取切口,顺子宫切除双侧卵巢,缝合皮肤,以云南白药粉做伤口预防感染药物,术后分笼饲养。术后第4周,采用数字化快速双能X线扫描骨密度仪检测大鼠右侧股骨的骨密度(Bone mineral density,BMD)值,OP模型均已建立成功[7]。

1.2.2 分组及给药:30只大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组,每组6只。建模成功后,根据人与大鼠表面积换算法[8]计算给药剂量。对巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠分别用1 ml注射器灌胃,浓度为50 mg/ml的1、2、3 ml巴戟天多糖溶液,其余组大鼠灌胃约2 ml的蒸馏水。各组大鼠均按每天2次灌胃,连续7 d。

1.2.3 ELLSA法检测:检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)水平。末次灌胃结束后,抽取各组大鼠腹腔动脉血3 ml,取30 μg匀浆离心,15 min后分离上清液,设置标准品孔、空白孔、反应孔并加入不同浓度梯度的标准品、稀释样品和蛋白裂解物,各50 μl,加酶密封,培养箱37 ℃孵育,1 h后弃去孔内液体,甩干洗涤加DAB显色底物,再入培养箱37 ℃孵育,15 min后加入终止液,多功能酶标仪检测波长在450 nm处吸光度值,用ELLSA试剂盒检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP水平。

1.2.4 股骨颈BMD、骨钙、骨磷含量测定:采用双能X射线骨密度仪检测各组大鼠股骨颈BMD值,BMD测定完成后,收集股骨置于800 ℃马弗炉中高温灰化,采用灰化的标本中用乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)滴定法,通过与金属离子发生络合反应,利用金属指示剂的光学方法滴定终点处,根据用量测定股骨颈中骨钙、骨磷含量。

1.2.5 废用残根牙槽骨骨小梁解剖结构形态计量学指标测定:采用显微CT扫描大鼠牙槽骨,记录废用残根牙槽骨骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨小梁厚度骨形态计量学指标。

1.2.6 骨生物力学参数测定:取大鼠股骨,剔除附着的肌肉组织并用0.9%氯化钠溶液纱布和锡纸包裹,置于-20 ℃冰箱保存,测定时,取出放入0.9%氯化钠溶液于室温下浸泡,3 h后取流变仪,对解冻的股骨进行加载速度为5 mm/min、跨距为8 mm的三点弯曲实验。通过载荷-变形曲线计算最大载荷、最大桡度、弹性载荷及刚性系数。

1.2.7 股骨组织CaBp-D9k和CaBp-D28k蛋白表达测定:取大鼠股骨组织标本剪切为细小碎片,加入裂解液,于12000 r/min离心10 min,留取上清液,收集蛋白。每100 μl的蛋白混合等体积5×上样缓冲液,浴箱中100 ℃加热5 min,待变性发生后进行10%的SDS-PAGE凝胶电泳,通过转膜、封闭、洗膜后加一抗CaBp-D9k(1∶200)、CaBp-D28k(1∶200),温度选择4 ℃孵育过夜,加入过氧化物酶抗兔IgG二抗(1∶2500),选择时间2 h封闭完成后加入洗涤液进行洗涤,10 min/次,重复3次。用DAB显色试剂盒在X线胶片感光、显影、定影完成后在暗室中完成显色。内参以GAPDH蛋白为标准,IPP 6.0软件检测蛋白电泳带灰度值、GAPDH条带灰度值比值,比较对比值。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP水平比较 见表1。与正常组比较,模型组大鼠TNF-α、IL-6水平升高,ALP含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠TNF-α、IL-6水平逐渐降低,ALP含量逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠组间比较,TNF-α、IL-6水平逐渐降低,ALP含量逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、ALP比较

2.2 各组大鼠股骨颈BMD及骨钙、骨磷含量比较 见表2。与正常组比较,模型组大鼠股骨颈BMD、骨钙、骨磷含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠股骨颈BMD、骨钙、骨磷含量逐渐升高,且巴戟天多糖高剂量组大鼠BMD、骨钙、骨磷含量最高(P<0.05)。

表2 各组大鼠BMD及骨钙、骨磷含量比较

2.3 各组大鼠骨形态计量学指标比较 见表3。与正常组比较,模型组大鼠废用残根牙槽骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量降低,骨小梁分离度升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠废用残根牙槽骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量逐渐升高,骨小梁分离度逐渐降低,且巴戟天多糖高剂量组大鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量最高,骨小梁分离度最低,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠骨形态计量学指标比较

2.4 各组大鼠骨生物力学参数比较 见表4。与正常组比较,模型组大鼠股骨颈最大载荷、最大桡度、弹性载荷、刚性系数均低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠股骨颈最大载荷、最大桡度、弹性载荷、刚性系数逐渐升高,且巴戟天多糖高剂量组大鼠组的最大载荷、最大桡度、弹性载荷及刚性系数最高,差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠骨生物力学参数比较

2.5 各组大鼠股骨组织CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白表达比较 见表5(图1)。与正常组比较,模型组大鼠股骨组织CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白表达均低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠股骨组织CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白表达逐渐升高,且巴戟天多糖高剂量组大鼠CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白表达最高,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠CaBp-D9k、CaBp-D28k蛋白电泳图

表5 各组大鼠股骨组织CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白表达比较

3 讨 论

OP主要表现为BMD减少,骨微结构断裂[9-10]。现代医学认为,巴戟天所含β-蒽醌、2,4-二乙基胆固醇、多糖等活性成分可预防组织氧化,保护肾脏,提高成骨细胞活性[11]。中医认为,OP由肾精弱骨骼失养引发[12-13]。巴戟天可滋补肾阳,益气强筋骨,平和脏器。巴戟天的多种提取物包括醚类化合物、寡糖及多糖等均可以刺激体外培养成骨细胞增殖,对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化发挥诱导作用,其中巴戟天多糖能够上调骨骼内矿物质及微量元素含量,效果明显。巴戟天为我国南方药材之中较为著名者,以肉质根入药,始载于《神农本草经》:“巴戟天,味辛,微温。生山谷。治大风邪气,阴痿不起,强筋骨,安五脏,补中增志益气”[14]。《本草纲目》曾介绍:巴戟天,性味甘辛,温,具有补肾壮阳、益精血、强筋骨、明目、消肿等功效,主治肾虚阳痿、遗精、早泄、腰膝冷痛、四肢无力、耳聋、目暗、久咳、癫痫等症状。巴戟天包含糖类、有机酸类以及微量元素等多种功能因子,除具有补肾壮阳、祛风湿等作用外,在抗抑郁、炎症、痛感、氧化、衰老及免疫调节等方面均有影响。巴戟天为双子叶属茜草科植物,属于酸性多糖,具有糖的特性和三股螺旋结构,溶解性较好,不含蛋白质或多肽,可强筋骨、安五脏,其有效成分中的巴戟天多糖可刺激成骨细胞合成、分泌和矿化,恢复骨骼重建的动态平衡,改善OP。巴戟天从中药药理的角度来看属于补虚药,其现代药理作用的临床应用也很广泛,对骨生长是其重要作用之一。巴戟天含有直接刺激体外培养成骨细胞增殖的成分,能够促进成骨细胞分泌ALP、骨钙素。巴戟天多糖作为巴戟天活性成分,对体外培养成骨细胞增殖具有促进作用,提高分化中成骨细胞分泌ALP水平,增加骨钙素,使局部磷酸根PO43-浓度升高,破坏钙化抑制剂,启动钙化,增加钙含量。

本文研究结果显示,与模型组比较,巴戟天多糖低剂量组、巴戟天多糖中剂量组、巴戟天多糖高剂量组大鼠BMD、骨钙、骨磷、ALP含量及CaBp-D9k与CaBp-D28k蛋白逐渐升高,血清TNF-α、IL-6水平逐渐降低,且生物力学功能改善明显,说明巴戟天多糖可抑制炎症因子活化,增加大鼠BMD、骨钙、骨磷及ALP含量,增强废用残根的咀嚼功能,并呈剂量依赖性。BMD可反映OP发展程度,与ALP共同由成骨细胞分泌合成,作为骨转换和骨形成的特异性指标出现。OP发生后,骨总量减少,骨钙、骨磷丧失明显,血清TNF-α、IL-6表达增高,对成骨细胞成熟进行抑制,加重骨吸收。咀嚼过程中,废用残根通过牙周膜作用,将垂直压力转换成拉力于牙槽骨上,牙槽骨骨小梁受拉力刺激增加,增强骨组织致密性,延缓患牙的牙槽骨吸收。研究表明,巴戟天多糖能够有效升高OP大鼠BMD含量,恢复血清磷水平,增加ALP分泌[15]。巴戟天多糖能升高OP大鼠BMD,增加尿钙、血钙、血磷含量,促进OP恢复[16]。文献证实,对切除卵巢后OP大鼠给予巴戟天多糖干预后,BMD升高,血清IL-6、TNF-α水平得到抑制,增加血清钙、磷等微量元素,并呈剂量依赖性,说明巴戟天多糖能提高切除卵巢后大鼠BMD,可能通过降低血清IL-6、TNF-α表达,刺激成骨细胞成熟,改善OP作用[17]。巴戟天含有丰富的多酚类化合物,如黄酮类和酚酸类,这些化合物具有强大的抗氧化作用,可以中和自由基,增强机体免疫功能,减少炎症反应和损伤。通过观察废用残根的骨小梁参数,可以了解骨小梁微观结构反映的咀嚼能力退化情况。骨生物力学将经典力学与骨科学相结合,对骨的力学问题进行分析,直接反映骨的结构与骨强度、硬度、韧性之间的关系,最大载荷、弹性载荷反映抵抗破坏能力,刚性系数、弹性模量代表骨抵抗变形能力。OP会引发钙吸收障碍,降低营养物质生物利用度,而CaBp-D9k、CaBp-D28k是肠道钙主动吸收的协助蛋白,CaBp-D9k、CaBp-D28k活性下降会加重钙吸收障碍,促进OP发展。巴戟天具有激活维生素D受体作用,维生素D在人体内被激活后,能够增加肠道对钙的吸收。因此,巴戟天通过激活维生素D受体,可促进钙吸收。研究表明,对OP大鼠主动增强咀嚼功能后,骨体积分数增加,骨小梁厚度、骨小梁数量升高明显,降低了骨小梁分离度[18]。咀嚼负荷减小会降低生长期大鼠下颌骨的力学性能,弱化咀嚼功能[19]。目前,临床应用巴戟天多糖对OP废用残根咀嚼功能的研究较少,巴戟天多糖可能通过改善OP大鼠废用残根牙槽骨骨小梁解剖结构形态计量学指标,提升咀嚼功能。有研究发现,对大鼠进行弯曲实验后,正常对照组大鼠弯曲破坏载荷、弯矩、弯曲应力、弹性模量等弯曲性能指标均大于OP组,说明OP会对骨结构力学产生影响[20],这与本文研究一致。巴戟天多糖可增加大鼠椎骨松质骨骨小梁面积,增加股骨最大负荷和模数,改善去卵巢OP大鼠模型的骨物理学骨生物力学和形态学指标,具有治疗OP作用[21]。研究显示,OP大鼠模型的小肠黏膜CaBP-D9k mRNA、CaBP-D28k mRNA表达水平下降[22]。有研究发现,维生素D3的活性代谢产物1,25二羟维生素D3[1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25(OH)2D3]可与维生素D受体结合,提升CaBp-D9K活性水平,延缓OP发展,增加CaBp-D9K基因转录[23]。研究表明,与空白组、假手术组相比,OP组大鼠血清1,25(OH)2D3水平和小肠CaBp-D9k mRNA表达降低,说明去卵巢大鼠OP的发生可能与肠黏膜CaBp-D9k mRNA表达降低所致的钙吸收障碍密切相关[24]。通过增加OP大鼠肠道CaBP-D9k基因表达,增强CaBP-D9k合成,可平衡负钙状态,抑制破骨,促进成骨形成[25]。本文认为,巴戟天多糖通过抑制炎症因子活化,增加骨钙、磷及BMD、ALP含量,增加钙离子在机体弥散速度,促进钙吸收,改善骨生物力学功能,实现治疗骨质疏松目的。

本研究表明,巴戟天多糖对骨质疏松具有明显保护作用,为临床治疗OP提供理论依据,但本文存在一定不足,存在时间及样本量不足,未进行更多实验组别及实验内容,可能对结果产生一定影响,后期应加强合作,扩大样本量,充实内容,为OP研究提供实验依据。