蒙药文冠木配方颗粒指纹图谱及含量测定研究

2024-03-14 03:48刘梦韩子璇杨立茹李佳程岚张纯刚辽宁中医药大学药学院辽宁大连6620长治医学院药学系山西长治046000祈蒙股份有限公司内蒙古赤峰024330
中南药学 2024年2期
关键词:儿茶素指纹批号

刘梦,韩子璇,杨立茹,李佳,程岚*,张纯刚,2,3*(.辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 6620;2.长治医学院药学系,山西 长治 046000;3.祈蒙股份有限公司,内蒙古 赤峰 024330)

文冠木为无患子科植物文冠(Xanthoceras sorbifoliaBunge.)的干燥茎枝,蒙药名为“森登”,可分为乌兰-森登、沙日-森登、苏木-森登等[1]。文冠木性凉、涩,味甘、微苦,具有祛风除湿,消肿止痛,敛干黄水的功效,临床上常用于治疗风湿性关节炎、风湿内热及皮肤湿热等[2]。现代药理发现文冠木具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保护血管等作用[3]。文冠木在临床上的治疗范围涵盖了巴达干症、赫依症、关节炎、各类热症、丹毒等病症,疗效显著,同时也是“森登-4味汤”“文冠木十味汤”“云香十五味丸”的常用药,拥有悠久的用药历史[2]。但目前关于蒙药文冠木的药典介绍及文献研究都不够全面,因此,本研究建立指纹图谱和含量测定的HPLC方法,并对其中14种指标成分进行含量测定研究,以期为蒙药材文冠木二次开发利用及药典标准的提升提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SHIMADZULC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司,包括四元泵、UV紫外检测器、Lab Solution工作站);CP225D十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];SG3300H超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司);Y-2摇摆制粒机(上海天和制药机械有限公司);WGL-230B电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品没食子酸(批号:110831-201906,纯度≥91.5%)、儿茶素(批号:110877-201604,纯度≥99.2%)、表儿茶素(批号:110878-201703,纯度≥99.2%)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,批号:112072-202101,纯度≥98.0%)、鞣花酸(批号:111959-201903,纯度≥88.8%)、芦丁(批号:100080-202012,纯度≥91.6%)(中国食品药品检定研究院);二氢杨梅素(批号:DSTSDE001201,纯度≥98.0%,乐天美医药);没食子儿茶素(批号:CRN1039)、表没食子儿茶素(批号:CRN0842)、二氢槲皮素(批号:CRN0451)、杨梅素(批号:CRN2642)、槲皮苷(批号:CRN0353)、槲皮素(批号:CRN1117)、柚皮素(批号:CRN0343)(纯度≥98.0%,湖北萃园生物科技股份有限公司)。乙腈(瑞典欧森巴克化学公司,色谱纯),甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯),磷酸(上海润捷化学试剂有限公司),纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司),文冠木药材细粉(批号WGM1~WGM15,祈蒙股份有限公司),经辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为无患子科植物文冠(Xanthoceras sorbifoliaBunge.)的干燥茎枝。

2 方法与结果

2.1 蒙药文冠木配方颗粒的制备

称取200.00 g文冠木细粉(过100目),加入适量辅料混合均匀,采用湿法制粒,选择水作为润湿剂,将黏度适中、混合均匀的软材利用摇摆制粒机(14目筛)制成湿颗粒,后将其置于60℃的烘干箱中干燥,照粒度和粒度分布测定法(通则0928第二法双筛分法)测定,得到15批文冠木配方颗粒(S1~S15)置于阴凉处备用。

2.2 色谱条件

色谱柱:COSMOSIL 5C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱(1~6 min,10%~13%A;6~11 min,13%A;11~25 min,13%~20%A;25~40 min,20%~40%A;40~50 min,40%A;50~60 min,40%~10%A);流速1.0 mL·min-1;检测波长270 nm;进样量10 μL;柱温30℃。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品适量,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇适量,超声(100 W,频率40 kHz,下同)15 min,放冷至室温,加甲醇定容,配制没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、EGCG、二氢杨梅素、鞣花酸、芦丁、二氢槲皮素、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素校正浓度分别为120.00、157.00、1315.00、320.00、252.00、150.00、186.00、105.00、100.00、100.00、100.00、67.00、150.00、250.00 μg·mL-1的单一对照品储备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取15批蒙药文冠木配方颗粒适量,研细,精密称取约0.500 g,置于10 mL量瓶中,精密称定,加90%甲醇适量,超声30 min,放冷至室温,用90%甲醇定容,摇匀,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,即得。

2.3.3 混合对照品溶液的制备 精密称取各单一对照品储备液适量,加甲醇配制为校正质量浓度分别为4.80、18.37、153.40、28.67、64.75、6.06、30.00、5.25、3.92、11.57、5.40、7.14、15.00、4.30 μg·mL-1的混合对照品储备液,于4℃保存,待用。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 参照物峰的选择 表儿茶素(8号峰)在15批样品中图谱中分离度好,稳定性较优,故选其作为色谱参照物峰,以计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.2 稳定性试验 取同一批文冠木配方颗粒(S1)供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样检测,计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果15批样品中的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤2.0%,表明供试品在室温下放置24 h稳定性良好[4]。

2.4.3 精密度试验 取同一批文冠木配方颗粒(S1)制备供试品溶液,连续进样6次,计算各个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果15批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤1.4%,表明仪器精密度良好[5]。

2.4.4 重复性试验 按“2.3.2”项下方法制备6份文冠木配方颗粒(S1),进样检测,计算得到15批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均≤1.7%,表明该方法重复性良好[6]。

2.4.5 指纹峰的指认 按“2.3.2”项下方法制备供试品,按“2.2”项下色谱条件检测,记录色谱图,与混合对照品色谱图比对保留时间,共指认14个共有峰,见图1。

图1 文冠木配方颗粒中色谱峰指认Fig 1 Chromatographic peak identification of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.4.6 指纹图谱的建立 制备15批文冠木配方颗粒供试品溶液,进样检测,记录色谱图。利用《中药指纹图谱相似度评价系统》(2012版)对色谱图进行分析,以S1为参照图,采用平均数法,经多点校正后,进行Mark峰匹配,系统生成15批配方颗粒的色谱图和对照图谱,标定21个共有峰,并与混合对照品的色谱图对比,指认14个色谱峰,分别为没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、EGCG、二氢杨梅素、鞣花酸、芦丁、二氢槲皮素、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、柚皮素。15批文冠木配方颗粒指纹图谱见图2。

图2 15批文冠木配方颗粒指纹图谱Fig 2 Fingerprint of 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5 15批蒙药文冠木配方颗粒含量测定

2.5.1 专属性考察 取混合对照品储备液、90%甲醇(空白溶剂)及供试品溶液适量,进样检测,记录色谱图见图3,14个色谱峰峰形良好,无杂峰干扰,表明本方法专属性较强[7]。

图3 文冠木配方颗粒指纹图谱专属性考察Fig 3 Specific test for fingerprint of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.3.1”项下单一对照品储备液,加甲醇定容于10 mL量瓶中,再用甲醇逐级稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液,得到校正浓度分别为各对照系列浓度。以峰面积为纵坐标(Y),对照品质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,计算回归方程,见表1。

表1 回归方程及线性范围Tab 1 Regression equation and linearity

2.5.3 加样回收试验 精密称取已知含量的6份文冠木配方颗粒,按对照品加入量与样品相应成分含量为1∶1的比例精密加入对照品溶液,按“2.3.2”项下方法处理后,进样检测,计算加样回收率,结果14种对照品平均加样回收率均在99.83%~106.96%,RSD值均≤1.8%[8]。

2.5.4 系统适用性考察 按照上述洗脱条件检测对照品和供试品溶液,记录色谱图,见图4。结果显示14个色谱峰峰形尖锐,对称性好;与前后峰的分离度均>1.5,达到基线分离;理论塔板数不低于3000[9]。

图4 系统适用性试验色谱图Fig 4 Chromatogram of the system suitability test

2.6 15批文冠木配方颗粒含量测定

精密称定15批文冠木配方颗粒0.500 g,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,进样检测,记录峰面积,采用外标法计算15批文冠木配方颗粒中14种成分的含量,结果见表2。

表2 15批文冠木配方颗粒14种成分含量测定结果(%)Tab 2 Content of 14 components in 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula granules (%)

2.7 化学模式识别分析

2.7.1 相似度评价 将15批文冠木配方颗粒色谱图导入《中药色谱图相似度评价系统》(2012年版),选定信号吸收和峰形较优、稳定性良好的21个色谱峰,系统自动计算生成15批配方颗粒的相似度,结果相似度均大于0.900,说明蒙药文冠木配方颗粒的制剂工艺具有良好的稳定性,但峰面积大小存在差异,说明各批次间成分存在差异。

2.7.2 聚类分析 将15批文冠木配方颗粒峰面积导入SPSS 25.0软件,采用组间连接的聚类方法,以欧氏距离为测量区间,进行系统聚类分析,结果见图5。15批配方颗粒(S1~S15)分为3类,S1~S5、S10、S7、S12~S13、S15为Ⅰ类,S9、S11、S14为Ⅱ类,S6、S8为Ⅲ类,颗粒间质量差异较大,与相似度评价结果一致。原料药材的产地、采收期、加工方式等都会影响药材质量,说明仅以一个或多个指标成分不能完全评价文冠木配方颗粒的质量,需要通过指纹图谱最大程度地反映整体的特征信息。

图5 15批文冠木配方颗粒聚类分析图Fig 5 Cluster analysis of 15 batches of formula granules

3 讨论

3.1 试验条件的考察

考察了流动相系统(乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水),柱温(20、30、40℃),检测波长(250、270、280、300 nm),流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)对含量测定的影响,结果发现,乙腈-0.1%磷酸水溶液,流速1.0 mL·min-1,检测波长270 nm条件下各特征峰响应值高,基线平稳。比较不同提取溶剂(80%乙醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇),不同料液比(1∶10、1∶12、1∶20、1∶25)和不同提取时间(30、45、60 min)对文冠木配方颗粒的提取效果,结果确定料液比1∶20,以90%甲醇超声提取30 min时所测成分的含量及分离情况最佳,杂峰干扰少。

3.2 文冠木配方颗粒指纹图谱和含量测定结果分析

15批文冠木配方颗粒的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度较高,均在0.900以上。由指纹图谱分析可知15批文冠木配方颗粒所含化学成分种类基本一致,但峰面积大小存在差异,聚类分析与相似度评价均提示各批次间成分含量存在一定差异性。目前市场流通的文冠木来源产地较为分散,地理环境影响了文冠木内代谢产物的生成和积累,并且各省市对药材验收的标准和限度各不相同,无法对文冠木进行客观准确的质控,是文冠木质量不稳定及开发利用受限的重要原因。

本研究在指纹图谱中共确认21个特征峰,指认出14个峰并进行含量测定,文冠木中含量最多的是黄酮类化合物,主要为黄酮化合物和二氢黄酮化合物,包括含量较高表没食子儿茶素、二氢杨梅素、二氢槲皮素、杨梅素等,是文冠木发挥抗炎、抗氧化、改善心血管系统的指标成分[10];没食子酸作为有机酸类化合物也对细菌、真菌等具有抑制作用;表儿茶素、儿茶素、鞣花酸等多酚类化合物则使文冠木具有调节免疫、抗氧化及抗肿瘤等生物活性[11],同时表儿茶素还具有抗凝血的作用等[12]。因此在指纹图谱基础上进一步对14种指标成分进行含量测定,为文冠木下一步的质量评价和药理活性研究奠定基础。由于含量测定与指纹图谱所用色谱条件相同,精密度、稳定性、重复性试验等方法学考察内容在指纹图谱中已考察且符合要求,因此,含量测定的方法学考察仅进行了线性关系、专属性和回收试验等内容。

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