基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和网络药理学的半夏炮制前后差异性物质基础及功效分析

石琨群,熊玥,钱香,朱育凤,姚毅,张倩,刘史佳

(1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院药学部,江苏 南京 210029;2.南京中医药大学第一临床医学院,江苏 南京 210023;3.江苏省畜产品质量检验测试中心,江苏 南京 210036;4.宜兴市中医医院儿科,江苏 宜兴 214299)

半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥块茎,味辛、性温,有毒,归脾、胃、肺经,有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效[1]。《中国药典》中收录的法半夏、姜半夏、清半夏,均为临床常用品种。陈丽君等[2]在810篇使用半夏的文献中发现,半夏炮制品的使用频率较高,共1 062次,占总次数的58.9%。不同炮制品的功效各有侧重:法半夏在炮制过程中辅以甘草,着重于祛寒痰;姜半夏为生半夏用水浸泡至内无干心时,加生姜与白矾共煮所得,着重于温中降逆止呕;清半夏是由白矾溶液浸泡或煮至内无干心得到,侧重于燥湿化痰[3]。尽管前期对半夏的化学成分研究较多,但尚未系统分析半夏及其炮制品的差异性成分,并挖掘差异性功效。本课题组前期已建立了半夏指纹图谱[4],并发现半夏炮制前后核苷类成分含量有显著差异。本文拟基于液质联用技术及多变量统计分析方法,对半夏及其炮制品的成分进行差异性分析并鉴定,进一步结合网络药理学分析半夏炮制前后不同的主要作用靶点,及差异性功效作用机制,为半夏及其炮制品的临床合理应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪配PDA检测器及Empower 3工作站(美国Waters公司);Triple TOF 4600超高效液相色谱-飞行时间高分辨质谱仪配OS及MasterView软件(美国SCIEX公司);FA1204型万分之一电子分析天平(常州市幸运电子设备有限公司);PL-S60T型数显超声波清洗机(东莞康士洁超声波科技有限公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 试剂

乙酸、甲酸、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司),纯水。

1.3 样品

半夏于当地农户处收集与市场购得后经生产加工,得其炮制品样品,由江苏省中医院朱育凤主任中药师鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。详细饮片信息见表1。

1.4 溶液制备

1.4.1 供试品溶液制备 取半夏及其炮制品样品粉末约2.0 g(过4号筛),精密称定,置50 mL具塞锥形瓶中,加入10 mL水,超声提取60 min(功率280 W,频率53 kHz),放冷后称定质量,用水补足减失质量,摇匀后过滤,取续滤液离心10 min(10 000 r·min-1),取上清液即得供试品溶液。

1.4.2 混合对照品溶液制备 分别精密称定各对照品,加水溶解配制成浓度分别为1.40、1.14、1.64、1.21、1.16、2.91、3.61、3.05、1.19、3.18、2.98、6.22、1.65 mg·mL-1的柠檬酸、琥珀酸、亚油酸、天冬氨酸、谷氨酸、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、腺苷、胸苷和6-姜辣素对照品储备液。精密移取上述各对照品储备液适量,配成含对照品浓度分别为9.33、9.50、10.93、8.07、11.60、19.40、24.07、20.33、7.93、21.20、19.87、10.37、11.00 μg·mL-1的混合对照品储备液。

1.5 色谱及质谱条件

1.5.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温:30 ℃;进样体积:1 μL;流速:0.2 mL·min-1;流动相A为0.1%乙酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脱:0～10 min,2%～5%B;10～20 min,5%～50%B;20～25 min,50%～95%B;25～30 min,95%B;30～30.1 min,95%～2%B;30.1～35 min,2%B。

1.5.2 质谱条件 采用ESI离子源,分别在正、负离子模式下采集数据。正离子模式:电喷雾电压为5 500 V,温度为500 ℃,雾化气体为N2,雾化气压力344.75 kPa(50 Psi),辅助雾化气压力344.75 kPa(50 Psi),气帘气为241.32 kPa(25 Psi);一级质谱扫描范围为60～1 000 Da,去簇电压为80 V;碰撞能量为10 eV;二级质谱扫描范围为60～1 000 Da,去簇电压为80 V,碰撞能量为35 eV,碰撞电压扩展能量为15 eV;开启动态背景扣除(DBS)。负离子模式:喷雾电压为-4 500 V;一级质谱去簇电压为-80 V,碰撞能量为-10 eV;二级质谱去簇电压为-80 V,碰撞能量为-35 eV;其他条件同正离子模式。

1.6 系统稳定性检测

将样本等量混合后制备得到质控样品,每进样10针样品进样1针质控样品,考察仪器的系统稳定。

1.7 数据分析

获取UPLC-Q-TOF/MS图谱后,采用Analyst©TF 1.7导出原始数据,使用MS-DIAL软件对数据进行峰提取、峰对齐等预处理,分别将处理后的正负离子下的数据表导入SIMCA14.0进行多变量统计分析。利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)将半夏炮制品和生半夏进行对比分析,通过变量重要性投影(VIP)值、P值和差异倍数(Fold change,FC)值筛选出差异性成分。并通过数据库及文献比对,对差异性成分进行鉴定。

结合上述差异性成分与文献报道,确定半夏及其炮制品的活性成分,在TCMIP数据库(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)中搜索成分以获取基因靶点。将得到的基因靶点导入String数据库(https://cn.string-db.org/)进行PPI网络分析,将PPI结果数据分别导入Cytoscape3.9.1软件,利用cytonca功能对结果进行拓扑属性分析,得到核心靶点。将核心靶点导入Metascape数据库(https://metascape.org/),进行GO富集和KEGG富集分析,富集均以P<0.01具有统计学差异。将得到的结果利用Cytoscape软件,作“中药-成分-靶点-通路”可视化图。

2 结果

2.1 总离子流图

正离子和负离子模式下,生半夏、法半夏、姜半夏、清半夏的总离子流图如图1所示。可以看出生半夏和炮制品之间存在差异,说明炮制后部分成分发生变化。

2.2 筛选差异性成分

将数据按“2.4”项下方法预处理后,将正负离子数据分别导入SIMCA14.1,经过log10(x+1)变换和Par缩放标准化后,进行PCA分析。正离子模式下得到有7个主成分的PCA得分图(R2X=0.813,Q2=0.739),负离子模式下得到有7个主成分的PCA得分图(R2X=0.793,Q2=0.693)(图2),可以看出生半夏和炮制品区分均明显,成分上存在差异。且由图可以看出QC样本聚集,且正负离子模式下均有大于70%的峰面积RSD≤30%(表2),说明方法和仪器稳定性良好(PCA是多维空间的二维投影,在投影中产生偏离是正常的)。分别将三种炮制品与生半夏做OPLS-DA分析,并进行200次置换检验(图3),结果显示,正、负离子模式下生半夏和三种炮制品均区分明显,检验未过拟合,模型预测能力良好。以VIP>1.5,P<0.01,FC>2或<0.5为标准筛选差异性成分。利用MS-DIAL软件导入msp文件[MA-DIAL官网中公共数据库MassBank、ReSpect、RIKEN IMS oxidized phospholipids、GNPS、Fiehn HILIC、CASMI2016、MetaboBASE、RIKEN PlaSMA authentic standards、RIKEN PlaSMA bio-MS/MS (MSI level 1,2,3, or 4)from plant tissues、Fiehn/Vaniya natural product library、BMDMS-NP及PFAS],将差异性成分与数据库中成分进行配对,并参考文献,最终鉴定出生半夏和其炮制品的差异性成分,见表3。

注:SBX.生半夏;FBX.法半夏;JBX.姜半夏;QBX.清半夏。A.正离子模式;B.负离子模式

正离子模式

表2 QC样本峰面积RSD(%)Table 2 RSD of peak area of QC sample(%)

表3 生半夏及其炮制品差异性成分Table 3 Analysis of the differences of Pinellia ternata and its processed products

由表3可知,生半夏和法半夏的差异性成分主要来自甘草,如甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、异甘草苷等。法半夏中酰胺类成分含量降低,有机酸类、酯类及3'-磷酸腺苷含量升高。生半夏与姜半夏差异性成分主要为核苷类、黄酮类、氨基酸类等,并由FC值可知:生半夏姜制后多种成分相对含量都降低,主要为鸟苷、黄嘌呤、酪氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸等;而磷酸腺苷相对含量升高。生半夏和清半夏的差异性成分与生半夏和姜半夏的差异性成分相似。此外,经白矾炮制后,鞘氨醇相对含量下降,但炮制后上调的成分未鉴定出来[5-7]。

2.3 网络药理学分析

结合文献[8-10]及差异性分析结果,选取生半夏中鸟苷、肌苷、黄嘌呤、酪氨酸、谷氨酸、鞘氨醇、琥珀酸7个活性成分,法半夏中腺苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、异甘草苷、麻黄碱7个活性成分。姜半夏6-姜辣素、腺苷、肌苷、琥珀酸、棕榈酸、柠檬酸6个活性成分。清半夏与生半夏相比,没有特有成分,靶点分析结果和生半夏相似,因此不将清半夏作为分析对象。据“2.4”项下的方法,从TCMIP网站获得生半夏337个基因靶点,法半夏372个基因靶点,姜半夏346个基因靶点。并通过String网站和Cytoscape3.9.1软件进行PPI蛋白互作分析,得到生半夏310个节点;法半夏304个节点;姜半夏311个节点。计算度值(Degree)、介数(Betweenness)、紧密性(Closeness)3个重要拓扑参数,选取均大于中位数且度值≥50作为核心靶点,得到生半夏67个核心靶点,法半夏45个核心靶点,姜半夏38个核心靶点,构建PPI网络(图4、表4)。结果可知,生半夏AKT1、EPRS、ALDH18A1、GOT2、GAD2,法半夏GAPDH、ACTB、AKT1、HSP90AA1、TNF,姜半夏GAPDH、AKT1、INS、MAPK3、SRC等靶点度值较高。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

表4 生半夏及其炮制品前10个核心靶点拓扑参数Table 4 Topological parameters of the first 10 core targets of Pinellia ternata and its processed products

对这些靶点进行GO功能注释和KEGG富集分析(图5～6),GO富集结果显示:生半夏共30条富集,其中20条Biological Processes,3条Cellular Components,7条Molecular Functions,涉及到氨基酸、核苷代谢与合成,烟酰胺代谢,突触传递与调节,细胞因子刺激反应,三羧酸代谢等;法半夏共40个,其中34条Biological Processes,3条Cellular Components,3条Molecular Functions,主要涉及对脂质的反应、腺体发育、前体代谢物和能量的产生、对脂多糖的反应、异物刺激反应等。姜半夏共33个,其中28条Biological Processes,3条Cellular Components,2条Molecular Functions,涉及前体代谢物和能量的产生、腺体发育、蛋白质运输调节、吞噬作用、类固醇激素反应等。KEGG结果显示生半夏主要参与氨基酸代谢与合成、Rap1信号传导、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、抑郁症和帕金森病的发生发展等;法半夏参与雌性激素信号传导、COVID-19、病毒性心肌病、扩张型心肌病的发生发展等;姜半夏参与癌症的中央碳代谢、核苷酸代谢、炎症介质对TRP通道的调节、酒精性肝病的发生发展等。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

利用Cytoscape软件将上述成分及对应的靶点通路作“中药-成分-靶点-通路”可视化图(图7)。生半夏6个成分(鸟苷、肌苷、黄嘌呤、酪氨酸、谷氨酸和琥珀酸)作用于AKT1、EPRS、ALDH18A1、GOT2、GAD2等67个靶点,涉及氨基酸代谢与合成、Rap1信号传导途径等13条代谢通路。法半夏7个成分(腺苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、异甘草苷和麻黄碱)作用于GAPDH、ACTB、AKT1、HSP90AA1、TNF等45个靶点,涉及雌激素信号传导、COVID-19的发生发展等11条代谢通路。姜半夏6个成分(6-姜辣素、腺苷、肌苷、琥珀酸、棕榈酸、柠檬酸)作用于GAPDH、AKT1、INS、MAPK3、SRC等38个靶点,涉及癌症的中央碳代谢、炎症介质对TRP通道的调节等10条代谢通路。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

3 讨论

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术检测半夏及其炮制品化学成分。网络药理学分析选取的生半夏活性成分主要为差异性分析中炮制品里降低的成分;法半夏特有性成分为甘草类,且有研究发现法半夏中未检测出肌苷[10];姜半夏特有性成分为6-姜辣素,且其有机酸含量最高;且与生半夏比较,炮制品生物碱、多糖含量降低[9]。因此选取这些成分作为活性成分。而清半夏仅用白矾炮制,与生半夏相比,没有特有成分,靶点分析结果和生半夏相似,因此不将清半夏作为分析对象。

网络药理学结果显示,半夏及其炮制品AKT1基因靶点度值均较高,由TCMIP预测结果可知,AKT1是鸟苷、腺苷的潜在靶点,在KEGG富集结果中参与Rap1信号传导途径。Rap1是Ras癌基因家族成员之一,有研究表明,Rap1可以通过ERK/p38信号通路促癌细胞转移,miR203可以通过下调Rap1的表达从而抑制细胞增殖、黏附和侵袭[11]。抑制AKT1表达可以抑制胃癌细胞迁移及侵袭,抑制肺癌细胞增殖,促进其凋亡[12-14],AKT1在肿瘤发展中发挥重要作用。也有文献报道,半夏总生物碱有抗肿瘤作用[15],推测核苷类生物碱成分可能通过AKT1调节Rap1信号途径参与肿瘤发展,抑制肿瘤细胞增殖迁移。

法半夏和生半夏的多变量统计分析结果显示,法半夏与生半夏的差异性成分主要为甘草中的成分,如甘草素、甘草酸、甘草皂苷G2等,这是因为法半夏是生半夏加入甘草炮制而成,并且由差异倍数FC值均大于2可以看出,甘草的加入对法半夏成分有较大影响。有研究表明,相较于生半夏,法半夏偏于祛寒痰和调和脾胃,多用于痰多咳嗽、痰涎壅盛和治疗新型冠状病毒感染的方剂中[16],法半夏KEGG富集通路结果也显示,其与新型冠状病毒感染的发生、发展相关,是与生半夏的差异通路。法半夏中富集该通路的靶点有FOS、IL2、JUN、PIK3CA、RPL11、TLR2、TNF、GNAS、HSP90AA1等,主要为麻黄碱、腺苷、甘草酸的潜在靶点,而甘草酸也是生半夏与法半夏的差异成分。刘宁等[17]分析武汉临床治疗新型冠状病毒感染验案,多种方药中均含有炙麻黄、甘草、法半夏等,临床疗效良好。法半夏佐以甘草,偏祛寒痰,而新型冠状病毒感染患者早期的基本病证属于寒湿闭郁脾肺,邪热内郁,治则当温散寒湿为主,兼以透热袪邪[18]。推测法半夏可能通过FOS、IL2、TNF等靶点,发挥抗炎、祛寒痰作用,治疗新型冠状病毒感染。此外,和生半夏相比,法半夏GO富集中生物过程还涉及到腺体发育,其关联靶点MAPK3、TNF、CASP3、CASP8等为差异成分腺苷、甘草素、甘草次酸、甘草皂苷G2的潜在靶点。呼吸道腺体分泌增加,可以降低痰液黏稠度,易于咳出,从而达到祛痰目的[19]。有研究发现甘草浸膏、甘草次酸能延长引咳潜伏期、减少引咳次数,具有祛痰止咳作用[20],且甘草作为中药常用辅料,可以和中缓急,调和诸药。因此,腺苷、甘草中甘草素和甘草次酸等差异物质基础可能是法半夏与生半夏相比,偏于祛寒痰止咳和胃的物质基础。此外,腺苷有镇静作用[21],文献报道腺苷有镇静作用,可能是法半夏发挥镇静作用的物质基础[16]。

姜半夏、清半夏与生半夏的差异性成分均多为核苷类、黄酮类、氨基酸类等,且由FC<0.5可知,姜制、白矾制后,半夏各成分的含量均有不同程度的下降,其中包括毒性物质鞘氨醇。鞘氨醇属于鞘脂类成分,是细胞膜组成成分之一。Tao等[22]发现生半夏给药组与正常组相比,大鼠血清中二氢神经鞘氨醇-1-磷酸(dhS1P)的表达上调。dhS1P是鞘氨醇激酶使鞘氨醇磷酸化的产物,细胞外dhS1P通过JAK/STAT-基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)信号通路增加STAT1、STAT3蛋白的磷酸化水平,促进TGF-β和TIMP1的表达,增加心肌成纤维细胞中的胶原合成,使心肌纤维化[23]。文献报道生半夏有心脏毒性[17],结合本实验结果,鞘氨醇等鞘脂类成分可能是生半夏毒性和清半夏炮制减毒的物质基础之一。有文献报道,有机酸类成分在姜半夏中含量最高[9],是姜半夏与生半夏的差异成分。且KEGG富集结果显示,与生半夏相比,姜半夏还与炎症介质对TRP通道的调节有关,该通道的靶点为差异成分棕榈酸、柠檬酸等有机酸的潜在靶点CALM1、PIK3CA、PRKACA、SRC等。有研究表明,刺激物经气道吸入后,经过TRP通道激活可以导致气道神经源性炎症而致咳[24]。半夏中有机酸类成分是镇咳、止呕的重要活性成分[16],而有机酸类成分在姜半夏中含量最高[9]。因此,有机酸类成分可能是姜半夏相较于生半夏,偏重镇咳、止呕的物质基础之一,并通过CALM1、PIK3CA等靶点调节TRP通道,发挥其止咳作用。和生半夏相比,磷酸腺苷的含量在姜半夏中也显著升高。磷酸腺苷是产生ATP的中间产物,可以为机体提供能量。差异成分腺苷的潜在靶点MAPK3、GAPDH、GSK3B等富集到的GO富集生物过程也表明其和前体代谢物和能量的产生有关。ATP有改善心肌的代谢作用,可以提高心肌收缩功能,用于治疗心动过速、心律失常、心力衰竭等[25]。生半夏有心脏毒性[15],但有研究发现,姜半夏能降低心律失常评分,缩短心律失常持续时间,减轻心肌细胞超微结构损伤[26]。因此,磷酸腺苷可能是姜半夏炮制减毒、保护心脏的物质基础之一。姜半夏还有降逆止呕作用,生姜中的6-姜辣素是其活性成分[27]。但与生半夏比较,姜半夏特有性成分挥发油及6-姜辣素未在差异性成分中鉴定出来,可能是因为本实验采用水提的方法,导致挥发油及姜辣素不易溶,含量较少,在整体成分中体现出的差异性较小,未达到筛选要求。这也在一定程度上反映出炮制对生半夏原有成分影响较大,一方面降低毒性,另一方面缓和药性,减少副作用。生半夏与姜半夏和清半夏的差异性成分结果相似,主要是因为姜半夏和清半夏炮制方法相似。清半夏是生半夏加白矾而制,长于燥湿化痰,其抗炎作用较生半夏强[16];姜半夏在此基础上又加入生姜,增加止呕药效。

综上所述,本文建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能够较好地分离鉴定半夏及其炮制品中的化学成分,能反映半夏炮制前后的主要差异性物质基础。并以此为基础结合网络药理学分析差异性功效的作用机制,为半夏及其炮制品临床合理应用提供数据支持。