不同方法检测食品中大肠埃希氏菌O 157:H 7/HM能力验证结果比较与分析

燕 妮，段 鹏，杨雅珺

（甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730300）

大肠埃希氏菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7）是一种能分泌志贺毒素的水和食源性人畜共患病原体，一旦感染会引起出血性腹泻，严重者可发展为出血性结肠炎和出血性尿毒综合征（HUS）[1-2]。美国和日本等国家均发生过由大肠埃希氏菌O157∶H7引起的不同规模的流行，我国江苏、安徽等地也曾发生过大肠埃希氏菌O157∶H7引起的食物中毒事件，该病已成为世界性的重要公共卫生问题之一[3]。大肠埃希氏菌O157∶H7 的感染主要是由于食用被污染的家畜、家禽的肉类、奶类及蔬菜、水果及水源等引起，因而要大力加强对这类产品的监测，提升大肠埃希氏菌O157∶H7 的检验检测能力，防患于未然。我国陆续发布的《食品安全国家标准食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[4]、《食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[5]等国家标准明确规定不得检出大肠埃希氏菌O157∶H7。

能力验证是一种常见的实验室间比对的外部质控手段，实验室通过定期参加能力验证，能有效提高实验室技术操作能力和分析鉴定能力，找出差距并加以改进，从而提高实验室自身的检验检测能力，提供外部质控考核结果，对全面提升食品检验检测实验室的技术水平、保障食品安全具有重要意义[6-7]。笔者单位参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中大肠埃希氏菌O157∶H7检测能力验证项目，旨在提升对食品中大肠埃希氏菌O157∶H7 的检验检测能力。本次实验分别应用国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验》（GB 4789.36—2016）第一法[8]和实时荧光PCR 方法对样品进行检测，为大肠埃希氏菌O157∶H7的日常检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品23-F568 和23-G520，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心发放；阳性对照菌株∶大肠埃希氏菌（ATCC 25922），Microbiologics；阴性对照菌株∶大肠埃希氏菌O157∶H7（NCTC 12900），广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心；0.8%生理盐水，实验室自制；改良EC 肉汤（mEC+n）、大肠埃希氏菌O157显色培养基、改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）、营养琼脂、革兰氏染色液、大肠埃希氏菌O157∶H7干制生化鉴定试剂盒，均采购自北京陆桥技术股份有限公司；月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG（LST-MUG），广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏阴性菌鉴定卡，法国生物梅里埃公司；大肠埃希氏菌O157 和H7 诊断血清，泰国Serotest；细菌DNA 提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），日本Takara；引物探针序列参考徐德顺等[9]，见表1，由华大基因合成。

表1 引物探针序列

1.2 仪器与设备

高压灭菌器，日本ALP公司；生化培养箱，德国美墨尔特公司；生物安全柜，新加坡艺思高科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自动细菌生化鉴定仪，法国生物梅里埃公司；ViiA7 实时荧光PCR仪，美国ABI公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品复原

根据组织方的参试指导书进行，样品用60 mL无菌生理盐水进行再水化。为了防止样品间交叉污染，保证实验结果准确，建议有条件的实验室检测不同样品时分别在2 个生物安全柜中进行，或2个样品操作之间对生物安全柜进行30 min 的紫外杀菌消毒[10]。

1.3.2 传统国标方法

样品的增菌、分离、初步生化实验、血清学鉴定、生化试验等步骤按照《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM 检验》（GB 4789.36—2016）第一法操作，同时作阳性对照和阴性对照实验。生化试验鉴定时自营养琼脂平板上挑取分纯的菌落，制成0.5 个麦氏浊度的均匀菌悬液，再通过生化鉴定试剂盒和VITEK 2 Compact全自动菌种生化鉴定系统分别进行生化鉴定试验。

1.3.3 实时荧光PCR试验

（1）DNA提取。取1 mL增菌后的mEC＋n肉汤加入到1.5 mL 无菌离心管中，10 000 r/min 离心1 min，将上清弃去，重复上述操作一次，然后根据细菌DNA 提取试剂盒说明书进行后续DNA 提取；（2）实时荧光PCR 扩增。扩增反应体系∶Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，探针1.0 μL，RoxⅡ0.4 μL，模板4 μL，ddH2O补齐至20 μL；扩增反应条件∶94 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸40 s，共45个循环，在60 ℃进行荧光信号检测。

2 结果与分析

2.1 样品菌落形态及初步生化反应结果分析

结果显示，样品23-F568在CT-SMAC平板及大肠埃希菌O157显色琼脂平板上均无菌落生长；而样品23-G520在CT-SMAC平板及大肠埃希菌O157显色琼脂平板上均有2 种形态菌落生长，其中1 种呈现大肠埃希氏菌O157∶H7的典型菌落形态，具体菌落形态和初步生化实验结果见表2。结果表明样品23-F568 中未检出大肠埃希氏菌O157∶H7，而样品23-G520 中有可疑菌落，还需通过进一步生化实验来进行验证。

表2 样品菌落形态及初步生化反应结果

2.2 血清学和生化实验结果分析

2.2.1 血清学试验

样品23-G520的可疑菌落在O157血清和H7血清中出现明显的凝集现象。

2.2.2 生化鉴定试剂盒试验

对样品23-G520 的可疑菌落用生化鉴定试剂盒进行生化实验，结果见表3，再结合血清学试验结果，表明样品23-G520中检出大肠埃希氏菌O157∶H7。

表3 样品23-G 520可疑菌落生化实验结果

2.2.3 VITEK 2 Compact细菌生化鉴定仪试验

VITEK 2 Compact 全自动细菌生化鉴定仪检测结果见表4，结果显示样品23-G520 中检出大肠埃希氏菌O157∶H7，且准确度较高。采用全自动菌种鉴定系统检测时，应选取在非选择性培养基平板上培养24 h 左右的纯化菌株，并将菌悬液调整到合适的麦氏浊度范围，这样才能获得最佳的实验结果。

表4 全自动细菌生化鉴定仪实验结果

2.2.4 实时荧光PCR试验

采用实时荧光PCR 检测方法对样品23-F568、样品23-G520、阴性对照、阳性对照及空白进行检测，结果显示样品23-G520 及阳性对照有特异性扩增，而样品23-F568及空白对照无特异性扩增，阴性对照虽有特异性扩增，但CT值大于30结果不可信，如图1所示。根据实时荧光PCR结果可以确定样品23-G520 中检出大肠埃希氏菌O157∶H7，这与生化试验鉴定结果一致。

图1 实时荧光PCR检测结果

3 结论与讨论

能力验证活动对检验人员的操作能力和经验要求较高，但除了检验人员的技术因素外，影响能力验证结果的因素还有很多，如样品的保存、样品的水化、加样的准确度以及培养温度和时间等[11-12]。因此，实验室做微生物能力验证实验时要注意以下几点∶（1）在参加能力验证项目前，应对所选项目的检验标准理解和掌握，提前备好检验项目所需的培养基、试剂和耗材；（2）收到样品后，如不立即进行检验，应将样品按《参试指导书》置于-15 ℃冷冻保存；（3）样品检验时要注意冻干粉是否完全水化，且水化后应立即进行检验，避免放置时间过长菌体死亡从而影响实验结果；（4）培养时要选择温度适宜、波动较小的培养箱，避免因温度不适宜对实验结果造成影响。

此次能力验证活动，实验室采用了常规生化鉴定试验结合VITEK 2 Compact 全自动微生物菌种鉴定系统对能力验证结果进行比对，再通过实时荧光PCR 方法进行验证，结果反馈为满意。传统国标法使用传统生化鉴定方法虽易于操作，但耗时较长，人为干扰较大；采用VITEK 2 Compact 全自动微生物菌种鉴定系统可将生化鉴定时间由24~48 h缩短至4~7 h，且准确率较高；与生化鉴定方法相比，实时荧光PCR方法操作简便省时，只需一步增菌就可进行DNA 提取及实时荧光PCR 试验，省去了后续划线、分离、培养、生化鉴定等一系列步骤，所需时间比传统方法更短，且有较高的特异性和准确度，但是检测成本较高。各实验室可结合自身实际，选用适合自己的方法，或者多种方法互相验证，提高结果的准确度。