异戊酸血症患儿临床特征、基因型及随访分析

孙宇宁 梁黎黎 丁 思 刘宇超 陈 婷 龚珠文 邱文娟 张惠文 顾学范 韩连书

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所 儿内分泌遗传科（上海 200092）

异戊酸血症（isovaleric acidemia，IVA，OMIM 243500）是亮氨酸分解过程中的代谢产物异戊酰辅酶A脱氢酶（isovaleryl‐CoA dehydrogrnase，IVD）缺陷，导致旁路代谢生成的异戊酸、异戊酰甘氨酸和3‐羟基异戊酸及异戊酰肉碱（isovalerylcarnitine，C5）在体内蓄积，可产生特殊“旱脚味”（主要由未结合异戊酸所致），导致急性酸中毒或多种脏器功能损伤的疾病[1]。发病率在不同国家差异较大，德国约为1/62500[2]，美国约为1/250000[3]。我国各地区发病率差异较大，我国台湾约为1/365000[4]，浙江省约为1/234000[5]，福建泉州地区的发病率为1/84469[6]。根据本院782 万新生儿串联质谱筛查数据，推测我国IVA的发病率为1/195492[7]。IVA为IVD基因变异所导致的常染色体隐性遗传病，IVD基因位于染色体15 q 14‐15，包括12 个外显子，长15 kb，编码394个氨基酸。IVA临床表现缺乏特异性，根据发病时间及临床表现，主要分为急性新生儿型、慢性间歇型和无症状型[8]。急性新生儿型患儿如不能得到及时的诊断和治疗，发病后致死致残率极高。IVA主要通过血C5、C5与乙酰肉碱（acetylcanitine，C2）比值（C5/C 2）、C 5 与丙酰肉碱（propionylcarnitine，C 3）比值（C 5/C 3）及尿异戊酰甘氨酸或3‐羟基异戊酸增高做出诊断，基因变异分析可明确基因变异类型[9]。本研究通过总结34例IVA患儿的临床资料及基因变异分析，为临床医师提高对该病的早期识别和诊断提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择 2012年4月至2023年10月在上海交通大学医学院附属新华医院儿内分泌遗传科明确诊断（或外院诊断复核明确），并进行治疗和随访的IVA患儿作为研究对象。纳入标准：①年龄0 天～4 岁8个月；②符合IVA 诊断标准[10]；③有临床发病情况记录。排除标准：基因检测结果已经排除IVA 的患儿或确诊为其他遗传代谢病的患儿。

本研究经上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会审查批准（NO.XHEC‐D‐2023‐220）。所有检查获得患儿家长或监护人的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 IVA 诊断标准 IVA 诊断依据为满足下述3 个条件中2 条：①血C 5 ＞0.40 μmol/L、C 5/C 2、C5/C3比值升高；②尿有机酸分析提示异戊酰甘氨酸＞2.0mmol/mol肌酐，或者伴有3‐羟基异戊酸增高；③IVD基因检出复合杂合或纯合致病或可能致病变异[11]。

1.2.2 临床资料收集 包括患儿性别、起病年龄、起病症状及新生儿筛查情况，一般实验室检验包括血常规、血气、乳酸、肝功能、血氨、电解质、血糖，血液中C5、C3、C2水平，C5/C2比值及C5/C3比值，尿中异戊酰甘氨酸水平，头颅核磁共振成像（MRI）结果以及基因检测结果。

1.2.3 血酰基肉碱和尿有机酸检测 采用串联质谱技术检测患儿血中C 5、C 3 及C 2 水平，并计算C 5/C 2 及C 5/C 3 比值。标本采集用干血滤纸片法，检测方法参考文献[12]。串联质谱仪为美国生物应用系统公司产品（API 2000/API 4000型）。采用气相色谱质谱技术检测尿异戊酰甘氨酸及3‐羟基异戊酸，检测方法参考文献[13]，气相色谱质仪为日本岛津公司产品（QP2010型）。

1.2.4 基因检测 应用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管提取患儿及其父母外周静脉血各2 mL 进行Sanger 测序或全外显子组测序。具体方法[14]：采用全基因组DNA 提取试剂盒（Qiagen，德国）提取DNA，用Covaris S220超声破碎仪（Covaries公司，美国）将基因组DNA片段剪切为200 bp左右片段，用全外显子捕获试剂盒（IDT公司，美国）进行捕获，用Illumina NovaSeq 6000测序仪（Illumina公司，美国）对捕获片段进行双端测序，测序片段长度为150 bp。测序产生的fastq数据用BWA比对到hg19参考基因组，获得的可疑变异通过查阅本地人群数据库、千人基因组（1000 G）和人群基因组变异频率数据库（gnomAD）以及疾病数据库（HGMD）进行分析；根据最新美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南对变异位点的致病性进行分析[15]。明确基因变异患儿的父母进一步进行 Sanger测序，以明确致病变异来源。

1.2.5 随访 随访截至2023年12月。每3～6个月门诊随访1 次，对无法按时门诊随访的患儿予以电话随访患儿的预后包括治疗情况，有无疾病急性发作，智力发育水平，常规生化检测包括血常规、肝功能、电解质、血气和血糖等检测结果，血串联质谱和尿气相质谱等复查结果。＜6岁患儿采用Gesell（0～6岁）发育量表评估患儿智力发育水平，结果用发育商数（DQ）表示。75 ＜DQ ＜85 为边缘水平，55≤DQ≤75为轻度发育迟缓，40≤DQ＜55为中度发育迟缓，25≤DQ＜40为重度发育迟缓，DQ＜25为极重度发育迟缓；对无法进行上述量表评估的患儿，由有经验的临床医生评估其语言、运动、认知功能及行神经系统查体。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 22.0统计软件进行数据分析。非正态分布计量资料以中位数（P25～P75）或中位数（全距）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

共纳入35例IVA患儿，排除1例（新生儿筛查阳性，随访后血串联质谱正常，并通过基因诊断排除）。最后纳入分析34例，男22例、女12例，男女比例1.8:1，患儿父母均非近亲婚配。其中15例为急性新生儿型，中位发病年龄为3d（范围2～9 d），死亡4例；3例为慢性间歇型，中位发病年龄24月（范围6～56月）；余16例均为新生儿筛查确诊的无症状型患儿。急性新生儿型IVA患儿首发临床表现为精神反应差（12例）、喂养困难（8例）、呕吐（5例）、皮肤可闻及特殊气味（2例）、低体温（1例）；慢性间歇型均为呕吐起病（3/3），1例尿液闻及“旱脚味”。

2.2 常规实验室检测结果

急性新生儿型IVA患儿发病时三系下降5例，代谢性酸中毒7例，血氨升高7例，肝功能异常6例，肌酸激酶升高2例，低血钙2例，低血糖2例。慢性间歇型3例患儿发病时均有代谢性酸中毒。

2.3 血串联质谱及尿气相色谱质谱检测结果

34 例IVA 患儿治疗前检测结果见表1。根据有无临床表现，将IVA患儿分为有临床症状组（n=18）[包括急性新生儿型（n=15）、慢性间歇型（n=3）]及无症状型组（n=16）。与无症状型组相比，有临床症状组血中C 5 水平，C 5/C 2 比值及C 5/C 3 比值以及尿中异戊酰甘氨酸水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 IVA患儿血串联质谱及尿气相色谱质谱治疗前检测结果[M(P25～P75)]

急性新生儿型患儿中共4 例死亡，均属新生儿期起病，为发病或死亡后确诊，未行新生儿筛查。4例IVA死亡患儿血中C5、C5/C2比值、C5/C3比值以及尿中异戊酰甘氨酸水平均显著升高，分别为9.85（7.02～16.20）μmol/L、0.54（0.45～1.04）、12.01（10.97～33.95）、979.88（969.96～989.80）mmol/mol肌酐。

2.4 头颅磁共振成像检查

6 例患儿行头颅MRI 检查，4 例出现异常改变，2 例未见明显异常。其中3 例为急性新生儿期型，1例为无症状型。受累部位无明显特异性：1例为基底节多发异常信号，1 例脑白质容积偏小，1 例双侧大脑脚及内囊受累，呈对称性斑片状改变，1例两侧脑室三角区异常信号。

2.5 基因变异检测结果

34 例患儿全部进行基因检测，其中28 例为复合杂合突变，4 例为纯合子突变，2 例仅携带1 种突变。共检出40 种IVD基因突变位点，其中错义突变30 种（75.00%），12 种为新发错义突变，分别为：c.958 G＞A、c.1174 C＞T、c.458 T＞C、c.994 A＞T、c.919C＞T、c.380T＞C、c.1012G＞T、c.1061A＞G、c.476G＞C、c.1016G＞A、c.1195G＞C、c.1232A＞C。另还有1种缺失突变（c.724_726del），1种基因内重复（chr15:40699822‐40708584，hg19），大小为8.76 kb，1种缺失插入突变（c.466‐3_466‐2delinsGG）。最常见的突变位点为：c.1208A＞G（n=8）。临床表现与基因变异类型未见明显相关性。

2.6 治疗

IVA 患儿急性期治疗主要为维持内环境稳定和对症处理，限制亮氨酸摄入，10%葡萄糖补充能量，静脉滴注碳酸氢钠纠酸，给予左卡尼汀（每日100～300 mg/kg）和甘氨酸（每日250～600 mg/kg）促进异常代谢物排出，伴严重高氨血症患儿给予苯丁酸钠或苯甲酸钠，1例患儿发病时因高氨血症行血液透析治疗。

间歇期治疗给予去除亮氨酸营养粉治疗。29例患儿根据病情严重程度，每天将普通食物与去除亮氨酸营养粉按1∶（1～3）比例喂养，或限制天然蛋白质的摄入，每日蛋白总摄入量至少达到同年龄同性别健康儿童推荐量的最小值；1例因病情较轻，未予去除亮氨酸营养粉治疗。30 例口服左卡尼汀，剂量为每天50～100 mg/kg，分3～4次给予。29例口服甘氨酸，剂量为每天150～200 mg/kg，分3～4次给予；1例患儿因病情较轻，未用甘氨酸治疗。摄入蛋白量及相关药物剂量根据患儿临床表型、生化指标、血串联质谱、尿气相色谱监测行个性化治疗。

2.7 随访

中位随访时间为5年8个月（范围1年3个月～7年9个月）。随访至2023年12月，急性新生儿型患儿共4例死亡，中位死亡年龄为8 d（范围4～50 d），死因中均有失代偿性代谢性酸中毒；其余11例中9 例出现智力发育落后（4 例患儿因家长拒绝行智力测试，仅由有经验的临床医生综合评估），2 例（例10、例13）智力发育边缘水平。3例慢性间歇型患儿发育落后，其中2例（例18、例19）表现为智力发育落后，1例（例17）表现为运动发育落后，活动耐力差，肌力下降。见表2。16例新筛检出无症状型患儿未见明显临床症状。

表2 IVA部分患儿发育评估结果

30例存活IVA患儿最近1次随访时与治疗前质谱检测结果详见表3。与治疗前相比，最近1次随访时尿中异戊酰甘氨酸水平显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），血中C 5 水平、C 5/C 2 比值和C 5/C3比值差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 IVA存活患儿30例最后1次随访与治疗前质谱指标比较

3 讨论

IVA 是最早明确诊断的常染色体隐性遗传的有机酸血症[1]，该病缺乏特异性临床表现，新生儿期有喂养困难、呕吐、脱水、嗜睡、昏迷、抽搐等非特异性临床表现，可发生急性脑病、代谢性酸中毒、高氨血症，慢性间歇期有反复呕吐、喂养困难、生长迟缓及智力障碍等，也有罕见的胰腺炎发作、肝纤维化、视神经萎缩等[11]。如不及时处理急性分解代谢异常，预后则不佳。本研究中死亡的4 例患儿均于新生儿期急性发病，未行新生儿筛查。有3例急性新生儿型患儿在出具新生儿筛查结果后明确诊断为IVA，患儿得到早期诊断与治疗，随访至今，该3例患儿中有2 例生长发育正常，1 例有生长发育落后，常规生化检测结果未见异常。随着新生儿筛查的应用，越来越多的无症状IVA 患儿得到诊断。本研究中超过半数患儿通过新生儿筛查检出，16例无症状患儿随访至今，均无明显临床症状，常规生化结果均未见异常。研究表明，异戊酸等代谢产物通过诱导氧化应激抑制大脑皮层钠钾 ATP酶活性从而引起神经系统损伤[16]。IVA的代谢危象发生时间、早期诊断与良好的神经认知结局相关。一项对155 例有症状IVA 患儿的分析表明，在出生后5周内诊断的患儿中，在初始代谢危象期间的病死率占1/3，而此后诊断的患儿病死率仅为3%；出生后5周内明确诊断并获得治疗的IVA患儿仅有15%出现神经系统损伤，而后期诊断的IVA患儿45%会出现神经系统损伤，神经系统的受损程度与诊治早晚有关，与疾病的急性发作次数及严重程度无关[17]。故新生儿筛查有助于疾病早诊断、早治疗，降低IVA患儿病死率，改善IVA患儿预后[18]。

随着血串联质谱和尿气相色谱技术在新生儿筛查的广泛应用，越来越多的患儿在临床症状出现前已获得明确诊断。一项纳入160 万德国新生儿的大型研究发现，新生儿筛查检测到的IVA病例中，近一半（11/24）被定义为“轻度或中度代谢异常”，随访这些患儿，可能终生无症状[2]。这也与本研究结果相一致。血C5是IVA的生物标志物之一，但由于C5和2‐甲基丁酰肉碱是同分异构体，还需结合C5/C3和C 5/C 2 比值升高以及尿中异戊酰甘氨酸升高综合判断，与新生儿短链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症相鉴别。此外，有些抗菌药物如匹氨西林、头孢菌素及特戊酸酯软膏含特戊酰肉碱，其使用会导致血中C5水平暂时性增高[19]。因此，尿异戊酰甘氨酸增多被认为是诊断 IVA 的特征性指标。一项来自西班牙的研究分别将血C 5 浓度6 μmol/L、尿异戊酰甘氨酸浓度195 mmol/mol肌酐作为切值，将IVA分为代谢轻型和代谢严重型，并以此长期随访代谢严重型患儿[20]。监测尿异戊酰甘氨酸浓度相比血C 5 水平更能评估疾病进展及预后情况。在本研究随访的30例存活IVA患儿中，经过治疗，尿异戊酰甘氨酸浓度显著下降，但本研究纳入各组患儿数量较少，无法用统计学方法分析出各组指标与疾病严重程度及预后的相关性。在长期的随访治疗中，仍缺乏确定的实验室检测指标监测疾病控制状态[21]，可能需要通过扩大样本数量及长期随访得以进一步明确。

目前已报道超过90 余种IVD基因变异（http://www.hgmd.org），其中多为错义突变[22]。本研究有2例患儿仅携带1 个突变位点，这可能与基因检测方法有关，也许存在小片段的基因缺失或重复序列未检测出，或是基因内含子区域的变异导致基因剪接异常，或存在特殊的基因修饰，对该2 例患儿，将继续采用不同方法验证上述猜想。关于IVD基因变异，不同国家或地区的热点变异有地域差异：美国及德国为c.932C＞T (p.A282V)[21]，南非为c.367 G＞A (p.G123R)[8]，韩国为c.457‐3_2CA＞GG[23]，泰国为c.457‐3_2CA＞GG[24]，中国台湾地区为c.1208A＞G(p.Y403C)[4]。相关研究报道了3例不典型IVA的儿童患者[25]，检测到6 种基因突变位点：c.157 C＞T、c.214G＞A、c.1183C＞G、c.1208A＞G、c.1039G＞A和c.1076 A＞G。另有研究报道了8 例IVA 患者，发现14种基因突变类型，其中c.1208A＞G占比最多[22]。中国柳州地区对2 095 名正常新生儿进行了高通量测序，检测到了10例IVD基因携带者，其中多达5例为c.1208 A＞G 突变位点携带者[26]。根据本研究和其他国内研究中检测到的IVA患儿的IVD基因变异类型，推测c.1208A＞G突变在中国具有较高的频率。目前尚无关于中国IVA 患者突变谱和热点的报告。然而，该变异位点是否是中国人群的热点突变，可能需要通过扩大样本量进一步验证。在基因型与临床表现或生化代谢相关性方面，有文献报道c.932C＞T(p.A282V)突变与无症状型IVA最为相关[2]，而在本研究中，无症状型IVA患儿无发现携带此突变。文献报道的2例携带c.640A＞G(p.T214A)突变的IVA患儿为无症状型[27]。本研究中有2例携带同一突变位点的患儿同样无明显临床症状，但按照生化代谢型分类分别属于“代谢轻型”及“代谢严重型”，中国浙江省新生儿筛查检出携带这一变异的2例患儿，有1例曾发生高氨血症[5]。这提示IVD基因变异具有临床表现异质性，基因型与临床表型和生化表型的关系还须进一步探索。

综上，本研究发现IVA 患儿临床表现无明显特异性，血C5、C5/C2比值和C5/C3比值及尿异戊酰甘氨酸增高对诊断异戊酸血症具有特异性。新生儿期急性发病的患儿病情危重，病死率高。未发现基因变异类型与临床表现有明显相关性。新生儿筛查有助于该疾病的早期诊断、治疗及预后。此外，因新生儿筛查检出仅有轻微生化异常的“无症状”患儿，其发生严重分解代谢风险及远期结局仍不明确，还需进行长期随访观察。