生态脆弱煤矿区水体中微生物群落特征及矿井充水指示

范立民 ，李 涛 ，高 颖 ，白如鸿 ，孙 强

（1.中国矿业大学 矿业工程学院, 江苏 徐州 221116；2.六盘水师范学院 矿业与机械工程学院, 贵州 六盘水 553004；3.陕西榆林能源集团有限公司, 陕西 榆林 719000）

0 引 言

煤炭资源开采必然发生矿井充水，有效识别矿井充水水源是矿井水害防治及水资源保护的重要一环[1-4]。特别在我国生态脆弱的西北地区，煤炭资源丰富，水资源却普遍缺少，但局部地区矿井涌水量大，对这些区域充水水源的精准识别，对于区域水资源保护和利用意义重大[5-7]。现有煤炭开采矿井充水水源识别的方法主要包括2 种类型。第一类为通过矿井充水的表观特征进行识别，包括水文常观孔水位、矿井水的水温、水压及涌水量等方面。曾一凡等[8]研究了我国矿井不同充水水源的主要特征，并提出了相关的防治措施。顾爱民[9]基于水动力学和水化学联合开展了突水水源识别的研究，有效提升了突水水源识别准确率。第二类为通过矿井充水水质的特征进行识别，又包括2 个方面的研究，一方面关注矿井水中的各种化学组成[10-13]，即常规水化学、微量元素水化学、同位素水化学、有机元素水化学等；另一方面关注水源识别算法的研究，即各类统计学方法[14-17]。大量的研究发现，以上方法对于水质比较相近的含水层识别成功率相对较低，算法的研究虽然可以提升，但仍需要更多的矿井水相关数据对水源识别进行有效支持。

近年来，微生物高通量测序技术取得了突破，一个水样或者土样就可以获取其中大量的微生物信息，弥补了化学成分相似的含水层矿井充水水源识别度的不足。矿业相关的研究者开始将该技术应用到矿井水污染机制方面的研究。李涛等[18]提出了一种基于微生物场特征突水水源判别方法，得到了突水水源微生物判别模式。张莉等[19]采用高通量测序技术研究了鄂尔多斯某煤矿不同功能区微生物群落特征，分析了采矿对微生物群落的影响，揭示了采矿对微生物群落的影响规律。朱璐璐[20]研究了门克庆矿微生物群落对矿井水水质的影响，获取了影响矿井水水质形成与演化的微生物群落特征及环境影响因素。孙亚军等[21]研究了微生物场、水化学场、水动力场对矿井水水质的综合作用，阐释了矿井水水质形成的多场耦合作用机制。李文博等[22]研究了700 m矿井中各类巷道微生物分布特征，发现了煤矿各类巷道拥有丰富的微生物多样性。康小兵等[23]研究了微生物数量识别闭坑矿井充水水源方法，提出了4种闭坑矿井充水模式。陈家玉等[24]研究了淮北煤田微生物群落特征，为矿井充水水源分析提供了新方法，发现了不同充水水源拥有不同的微生物群落特征。

高通量测序技术带来了大量微生物场数据，但已有的研究认为pH、离子种类、数量、含氧量及生物活动等均会影响水中微生物群落结构[18-24]，单一方法识别矿井水源存在局限性。为此，以榆树湾煤矿涌水量异常巨大为研究背景，开展了含水层和矿井水微生物场特征统计分析，结合矿井充水水文地质条件，综合研究了榆树湾矿井充水模式。

1 研究区概况

1.1 研究区范围

研究区选择处于大规模开采阶段的陕北侏罗纪煤田榆神矿区一期规划区水文地质类型复杂的榆树湾煤矿。研究区属于生态脆弱区，地处毛乌素沙漠与陕北黄土高原接壤地带，以风沙滩地地貌为主，浅表水资源相对丰富，煤炭开采水资源保护意义重大。

1.2 研究区采矿地质条件

1）研究区水文地质条件概况。榆神一区综合地层如图1 所示，其中煤层主要赋存延安组，上覆直接充水含水层为直罗组（榆树湾煤矿非古河道区[25]，弱富水），直罗组上为100 m 以上巨厚的保德组和离石组土层（无天窗，整体相对隔水层，但离石组弱富水），风积沙和萨拉乌苏组构成了潜水含水层（中等富水）。此外，区内民井统一揭露离石组、萨拉乌苏组和风积沙含水层，称之为松散含水层。

图1 研究区综合柱状图Fig.1 Comprehensive column chart of strata in study area

2）研究区采矿概况。榆树湾煤矿首采2-2号煤，采用分层开采方法，目前开采上分层采厚为5 m。煤矿生产规模1 000 万t/a，已经开采了15 a。榆树湾煤矿矿井涌水量近3 a 保持在1 000 m3/h 左右，其中老采空区（一盘区已经开采的10 余个工作面）的涌水量约占总涌水量70%。本矿导水裂隙带发育高度实测发现：已开采区域导水裂隙带仅发育到离石组黄土的底部（图2，按照28 倍裂采比计算），未波及萨拉乌苏组（距离萨拉乌苏组50 m 以上）。如图3 所示，布置在萨拉乌苏组的常观孔显示：3 a 潜水位随着降雨有所波动，同期未发现明显的水位下降（最大幅度下降约1 m）。

图2 榆树湾煤矿2-2 号煤开采导水裂隙发育预测Fig.2 Prediction of development of water conducting fractures during mining of coal seams 2-2 in Yushuwan Coal Mine

图3 榆树湾煤矿萨拉乌苏组水位动态观测曲线Fig.3 Dynamic observation curve of water level in Sarawusu Formation of Yushuwan Coal Mine

由于榆树湾煤矿未发现其他特殊导水通道（断层、天窗等），现有技术发现直接充水含水层为弱富水直罗组基岩含水层[26]，但矿井涌水量异常巨大。因此本次研究采用高通量测序技术对榆树湾矿井充水水源进行进一步识别。

2 研究方法

2.1 水样采集

对研究区范围设置了10 个取样点，每个取样点采集水样3 个，共计采取30 个样品，各水样的取样来源见表1。水样原位获取存储在无菌瓶，在榆林水文实验室进行初步过滤处理，初步处理后的样品送西安生物实验室开展水样微生物高通量测序。

表1 研究区水样点Table 1 Water sampling points in research area

2.2 高通量微生物测序原理及方法

2.2.1 高通量测序技术

高通量测序技术区别于传统Sanger（双脱氧法）测序，是能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100 MB 的测序数据。

2.2.2 高通量测序方法

高通量测试流程如图4 所示，主要包括样品采集（本次采集30 个样品）、微生物DNA 提取（采用Nanodrop 对DNA 进行定量）、目的片段扩增、扩增产物钝化回收、测序文库的制备（采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库）、上机高通量测序（图5）、拼接质控、序列聚类及数据分析。其中数据分析又包括常规分析、高级分析和个性化分析（图4），研究主要采用常规分析。

图4 高通量扩增子测序流程Fig.4 High throughput amplicon sequencing process

图5 高通量测试数据分析Fig.5 High flux test data analysis

3 结果及分析

3.1 微生物多样性分析

微生物多样性分析以Alpha 多样性分析和Beta多样性分析为主，两者分别表征物种在生境内和生境间的多样性。

3.1.1 Alpha 多样性分析

本次测定的结果如图6 所示，包括了7 种多样性指数，其中不同指数表征信息主要包括丰富度、多样性、均匀度和覆盖度，合并叙述如下：

图6 Alpha 多样性分析结果Fig.6 Alpha diversity analysis results

1）细菌Chao1 和Observed species 指数分析（丰富度）。①S2 样品（松散层）微生物丰度最高，S10 和S5（直罗组）水样微生物丰富度最低。说明松散层微生物较直罗组中微生物更丰富。②矿井水微生物丰度（S1、S3、S8、S9）位于中线附近，与矿井充水最为接近的水样为S6（松散层+直罗组），表明矿井充水中微生物多样性与松散层混合直罗组含水层微生物多样性相似。③对比S2（松散层）和S7（离石组），可以看出S7 更为接近榆树湾矿井充水，因此可见矿井水中松散层中的水样主要来源为松散层中的离石组黄土。

2）细菌Simpson、Shannon 和Faith 指数分析（多样性）。①Simpson 指数总体规律明显与Chao1 指数有差异，说明微生物丰富性和多样性存在差异。②所有水样的Simpson 指数集中在0.73～0.97，说明矿区水中微生物多样性较高。③S1 样品来自榆树湾煤矿最大的矿井涌水点，该水样微生物多样性与S2水样最为接近，其次接近S7、S5，说明现有榆树湾矿井涌水主要受到松散层和直罗组的影响。

3）细菌Pielou 指数分析（均匀度）。Pielou 指数仅反映均匀度，数值越大，越均匀。图6 可以看出S5（钻孔取出的天然地下水）的Pielou 指数最大，即其最为均匀。S3（正在开采人为扰动的工作面涌出水）的Pielou 指数最小，即其最不均匀。由此可见，人类活动对矿井水的微生物群落影响很大，这与前人研究结果相似[21]。

4）细菌Coverage 指数分析（覆盖度）。所有水样的细菌Coverage 指数普遍大于0.988，说明覆盖度很大，说明本次测序结果代表了微生物的真实情况。

5）Alpha 多样性综合分析。①测试的结果通过了Coverage 指数检验，总体可信。②丰富度分析表明：松散含水层水样中微生物种类最多，直罗组水样中微生物种类最少，榆树湾矿井涌水介于两者之间，即榆树湾煤矿充水水源除直罗组外还有松散层中的离石组黄土含水层参与。③测试的多样性分析表明：S3 水样（榆树湾煤矿20113 工作面涌水）多样性指数最大，受人类活动影响最为显著，因此表现出复杂的微生物多样性。S5 水样（直罗组含水层）的Shannon指数最小，微生物类型最少。榆树湾煤矿S1（最大矿井涌水点）的微生物多样性与S2、S7 和S5 接近，也说明榆树湾矿井涌水主要由松散层和直罗组组成。

3.1.2 Beta 多样性分析

通过主坐标分析(Principal Coordinate Analysis，PCoA)，非度量多维尺度分析(Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS)等非约束排序手段对多维微生物数据进行降维，并通过对样本在连续排序轴的分布，展示数据变化的主要趋势；同时也可通过聚类分析的手段识别环境中不连续对象的子集，对数据进行分类。采用以上3 个分析方法分别分析如下：

1） PCoA 分析。对10 个点30 个样品进行了PCoA分析，结果如图7 所示，可以得到以下结果：①同一取样点测试的3 个样品距离很近，说明重复性很强。②同一含水层的不同地点取样测试结果显示，黄土层、松散层有较好的重复性，但直罗组和矿井水重复性较差，即水中微生物群落影响因素较多。③矿井涌出水与直罗组和离石组有交叉区域，说明矿井水中有一定的直罗组和离石组水，研究区矿井水充水表现出多水源特征。④矿井涌出水中S1 与松散层最为接近，说明直罗组静储量释放后，矿井涌出水中松散层（萨拉乌苏组+离石组黄土）有所增加。

图7 PCoA 分析的样本二维排序Fig.7 Sample two-dimensional sorting chart for PCoA analysis

2） NMDS 分析。NMDS 结果的Stress 值越小越好（小于0.2），NMDS 分析的结果较可靠。本次分析结果如图8 所示，其Stress 值为0.058 9，可见分析结果可靠。对NMDS 结果分析，可以得到以下结果：①榆树湾煤矿松散层S2 水样同一地点的取样测试有一定距离，说明重复性不强。这可能与S2 人类活动密集有一定的相关性（风井建设中大量工程作业）。②矿井水与直罗组和离石组有明显的交集，说明矿井水构成中有直罗组和离石组水源，研究区矿井水充水表现出多水源特征。③矿井水中S1 与松散层最为接近，说明直罗组静储量释放后，矿井涌出水中松散层（包括黄土层）有所增加。

图8 NMDS 二维排序Fig.8 NMDS 2D sorting diagram

3）聚类分析。对10 个点30 个样品进行了聚类分析，结果如图9 所示，可以得到以下结果：①整体上聚类分析对各类水源有较好的区分，但松散层中的S2 较为离群，这与前面的Alpha 多样性分析结果一致。结合取样点分析，该点受人类活动扰动有所变化。②聚类分析对矿井水和天然含水层有较好的区分，而矿井水没有跟某一类水源有较好的聚类关系，说明矿井水的水源是多种天然地下水的集合。③矿井水短期内与天然含水层更为接近，而在采空区内相对封闭环境和基岩含水层的疏干，微生物菌落发生了进一步的变化。

图9 基于样本距离矩阵的聚类树Fig.9 Cluster tree based on sample distance matrix

3.2 微生物构成差异分析

微生物构成差异分析包括多种类型，本次开展分类单元数统计分析、分类学组分分析和物种热成像图分析。

3.2.1 分类单元数统计分析

计算不同样本在各分类水平所含有的分类单元的数目，并绘制成柱状图，结果如图10 所示，可以看出：

图10 各水平微生物分类单元数统计Fig.10 Statistical of number of microbial classification units at different levels

1）分类单元数目最少的是S5 和S10，说明受人类活动扰动影响较小。分类单元数目最多的是S2，该水样前面已经提及受人类活动扰动影响显著。

发展微电网的目的主要有三个：一是通过柴油机、小风电、分布式光伏等独立发电系统，解决与大电网联系薄弱的农村和偏远地区用电问题；二是在可再生能源高渗透率地区，通过微电网这一稳定的电力供应平台，实现分布式可再生能源的消纳和多种能源的高效利用；三是作为大电网的备用和补充，满足对电能质量和供电可靠性有特殊要求的用户需要和特殊时期的应急供电。

2）榆树湾最大涌水点S1 平均由30 个门、78 个纲、136 个目、158 个科、180 个属、41 个种的微生物群落构成。这与直罗组天然含水层微生物分类单元数目相差较大。由此可见，榆树湾煤矿矿井充水由多种水源共同构成。

3.2.2 分类学组分分析

使用去除singleton 后的特征表，实现各样本在门分类水平上的组成分布的可视化，分析结果如图11所示，可知以下3 点结论：

图11 门分类水平物种组成柱状图Fig.11 Bar chart of species composition at the phylum classification level

1）所有水样中最为优势的门类为变形菌门，占比达到35.5%～89.7%，这类微生物最少出现在离石组中。榆树湾矿井最大涌水点S1 中的变形菌门介于离石组和直罗组之间。

2）放线菌门在直罗组中占比较高，达到29.0%～29.1%。这与正在开采的工作面涌出水中的含量占比最为接近，其占14.7%～15.9%。

3）基岩含水层静储量疏干后的S1 水样，除最为优势的变形菌门以外，还有厚壁菌门占比最高，达到14.1%～15.2%。这与松散含水层S2 该类菌门的含量最为接近。

3.2.3 物种组成热图分析

一般常使用属水平的分类单元组成作为分析对象，因此默认使用平均丰度前50 位的属的丰度数据绘制热图，结果如图12 所示，可以看出：

图12 双聚类的属水平物种组成热图Fig.12 Genus level species composition heatmap of biclusters

2）正在开采的采煤工作面涌出水S3 与采空区稳定后的涌出水较为接近（横向聚类为统一类型），以不动杆菌属（Acinetobacter）、动性杆菌属（Planomicrobium）等微生物丰度最高。

3）松散层S2 和S4 距离矿井充水水样最远，以新鞘脂菌属（Novosphingobium）、梭杆菌属（Fusobacterium）、硫属（Sulfuricum）等微生物丰度最高。

4）直罗组S5 水样最接近最新涌出的矿井涌水样，以丛毛单胞菌属（Comamonas）、蛲虫属（Vermiphilaceae）、巴氏杆菌（Paeniglutamicibacter）等微生物丰度最高。

3.3 榆树湾煤矿充水特征综合分析

1）榆树湾煤矿充水微生物特征分析。榆树湾煤矿最大的矿井涌水点S1 水样的Shannon 指数、Faith指数、Simpson 指数和Pielou 指数与S2、S7 和S5 水样相近，说明现有榆树湾矿井涌水主要来自松散含水层和直罗组含水层，PCoA 和NSDM 分析佐证了这一结论。Beta 多样性分析显示榆树湾煤矿老采空区涌出水与松散层最为接近，说明直罗组含水层静储量释放后，榆树湾矿井充水水源构成中离石组黄土层的水有所增加。为进一步剖析充水水源，结合矿井充水因素分析如下。

2）榆树湾煤矿充水通道分析。榆树湾煤矿充水水源主要受充水通道影响，充水通道主要包括采煤导水裂隙带和其他导水构造或天窗。

关于导水裂隙带：榆树湾煤矿已有的导水裂隙带高度实测结果显示裂采比最大为28 倍，以28 倍裂采比计算的导水裂隙带发育结果如图2 所示。可以看出，目前已采区导水裂隙带直接沟通延安组含水层、直罗组含水层及部分离石组含水层，富水性中等萨拉乌苏组含水层未导通。

关于其他导水通道：根据目前榆树湾煤矿钻孔、地震及采掘工程揭露可知井田范围内无断距大于5 m 的断层。此外，榆树湾煤矿土层厚度十分稳定，为榆神府矿区已经开采范围内厚度最大的矿井，其厚度普遍超过100 m，且矿井未发现天窗存在。分析榆树湾2015—2022 年开采面积与矿井涌水量关系（表2），两者有较好的线性关系（式（1），R2=0.93），而榆神矿区另一个典型天窗充水矿井（锦界煤矿，涌水量巨大）开采面积和矿井涌水量的相关性较差[27]，这与锦界煤矿天窗区和非天窗区充水条件差异较大有关。综合说明了榆树湾矿井充水条件相对稳定，未受突变性较大的构造或天窗影响。

表2 榆树湾煤矿矿井涌水量与采空区面积关系Table 2 Relationship between water inflow and goaf area in Yushuwan Coal Mine

式中，Q为矿井涌水量，m3/h；F为累计采空区面积，km2。

3）榆树湾矿井充水模式。综合榆树湾充水水文地质和微生物群落特征分析，可以看出：榆树湾煤矿的充水模式为基岩含水层快速释水+离石组含水层持续释水模式。其中主要论据有2 个方面。

一方面，通过矿井各涌水点的统计如图13 所示，可以看出：矿井正在回采的工作面涌水量仅占总矿井涌水量的4.13%，掘进过程产生涌水量占总矿井涌水量的3.16%，井筒涌水量占总矿井涌水量的16.31%，而老空水量则占总矿井涌水量的76.40%。说明榆树湾矿井总的涌水量主要来自持续释放的离石组松散含水层，而榆树湾煤矿“三带”探查钻孔揭露到采空区上方直罗组基岩含水层水消失即为佐证。

图13 矿井涌水量构成Fig.13 Composition of mine water inflow

结合图7 PCoA 分析结果，S1（老采空区涌水点水样）与S7（离石组黄土含水层）接近，说明目前榆树湾煤矿总的矿井涌水与离石组含水层持续释水密切相关。水样微生物群落分析验证了这一结论。

另一方面，对开采工作面的涌水量的持续观测结果如图14 所示，可以看出：煤炭开采过程中以直罗组等基岩含水层快速衰减的含水层为主。采煤工作面推进约800 m 位置时，工作面涌水量开始快速衰减，最终工作面涌水量衰减到巅峰时期涌水量的41.86%。说明榆树湾矿井总的涌水量中仅有回采的工作面中有明显的基岩快速释水。结合图8 NSDM分析结果，S3（正在开采工作面涌水点水样）与S5（直罗含水层）最为接近，证明了这一结论。

图14 矿井工作面涌水量动态观测Fig.14 Dynamic observation of water inflow in mining face

综合以上两点，榆树湾煤矿充水模式可以概括为基岩含水层快速释水+离石组含水层持续释水模式。其中松散层持续充水原理与我国东部矿区土层持续释水相似（土层发生了持续固结释水）[28]。

4 结 论

1）关于高通量测序用于矿井充水识别的研究方面：将含水层和矿井涌水水样进行高通量测试，测试结果通过了Coverage 指数检验，相关识别结果被矿山水文监测和导水裂隙带观测结果佐证，说明高通量测序可用于矿井充水分析。但人类活动密切接触的水样显示出被污染特性，需要在取样中有效规避。

2）关于矿井水中微生物群落特征方面：榆树湾煤矿浅表松散含水层中微生物丰富度和多样性都较高，以新鞘脂菌属（Novosphingobium）、梭杆菌属（Fusobacterium）和硫属（Sulfuricum）等微生物丰度最高；直罗组为代表的基岩含水层微生物丰富度较低，但微生物多样性较高，以丛毛单胞菌属（Comamonas）、蛲虫属（Vermiphilaceae）和巴氏杆菌（Paeniglutamicibacter）等微生物丰度最高。所有水样中最为优势的门类为变形菌门，占比达到35.5%～89.7%。

3）关于榆树湾煤矿矿井充水模式方面：Alpha 多样性分析显示，榆树湾矿井涌水主要主要来自松散含水层和直罗组含水层，PCoA 和NSDM 分析佐证了这一结论。Beta 多样性分析显示，榆树湾煤矿老采空区涌出水与松散层最为接近，直罗组含水层静储量释放后，榆树湾矿井充水水源构成中离石组黄土层的水有所增加。因此，榆树湾煤矿为基岩含水层快速释水+离石组含水层持续释水的充水模式，这一结论得到了矿井涌水规律的证实。