NDUFA13 过表达可减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化：基于抑制NLRP3 活化

徐小惠，冯金梅，罗 颖，何昕觎，臧金宝，黄道超

1重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所//国家儿童健康与疾病临床医学研究中心//儿童发育疾病研究教育部重点实验室，重庆 400014；2重庆医科大学附属儿童医院心内科//国家儿童健康与疾病临床医学研究中心//儿童发育疾病研究教育部重点实验室//国家临床心血管内科重点专科//重庆市卫生健康委儿童重要器官发育与疾病重点实验室，重庆 400014；3重庆市九龙坡区第二人民医院检验科，重庆400052

肝纤维化是由遗传因素、病毒感染、毒物暴露等引起肝损伤后组织的自我修复反应，主要表现为肝内结缔组织增生和细胞外基质沉积，是各种慢性或急性肝病的共同病理过程［1-3］。临床上很多肝纤维化后期发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝癌，严重影响患者生存质量［4］。而对于终末期肝纤维化患者的治疗，除了肝脏移植，目前仍缺乏有效手段。因此，探究肝纤维化发病机制，寻找有效的预防及治疗靶点，对于肝纤维化的早期防控具有重要意义。

肝纤维化的发病机制涉及氧化应激、铁死亡及线粒体功能障碍等［5］。其中，线粒体作为细胞能量与代谢中心，在肝纤维化病理进程中的重要作用近来备受关注［6,7］。如肝纤维化的发生往往伴随肝细胞线粒体结构异常或功能紊乱［6］。线粒体内膜蛋白NDUFA13，是线粒体呼吸链NADH脱氢酶复合体Ⅰ的功能亚单位［8］。我们前期研究揭示了NDUFA13缺陷可诱导小鼠慢性自发性肝炎和肝纤维化病理表型，并通过肝脏NDUFA13特异性敲除模拟了一种自发性、慢性肝纤维化动物模型［9,10］。而NDUFA13蛋白是否涉及CCl4诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化，其作用及调控机制仍需进一步探究。

炎症小体作为机体固有免疫系统感受器，是参与肝脏炎症和肝纤维化的重要炎症信号分子［11］。其中Nod样受体蛋白3（NLRP3）是炎症小体家族的经典成员，与肝纤维化的紧密联系已被广泛报道［12-14］。课题组最新研究发现，胃黏膜壁细胞中NDUFA13 表达缺失通过ROS-NRF2-HO-1-NF-кB信号轴触发NLRP3炎症小体激活，且腹腔注射NLRP3抑制剂可显著减轻NDUFA13敲除诱导的小鼠胃炎病理表型［15］。另有文献报道，NDUFA13是NLRP3炎症小体活化的重要上游调节蛋白［16］，但靶向NDUFA13蛋白而抑制NLRP3炎症小体通路激活，能否成为减轻肝脏炎症甚至逆转肝纤维化进程的有效手段，尚无相关研究报道。本研究探讨NDUFA13蛋白在CCl4致小鼠肝纤维化中的保护作用，并基于NLRP3信号探索其可能机制，为抗肝纤维化的治疗策略提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物 BALB/C小鼠（7～8周龄，SPF级，体质量22±3 g）购买于重庆医科大学动物实验中心。所有小鼠均饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心，SPF环境下（12 h光暗循环），温度22～24 ℃，相对湿度40%～50%，自由采食与饮水。分别在CCl4诱导3、5、7周后处死小鼠，获取肝组织样本用于实验检测。所有操作均遵照实验动物伦理学要求（伦理编号：CHCMUIACUC20210114023）进行。

1.1.2 主要试剂 Masson染色试剂盒（索莱宝），四氯化碳（CCl4，Sigma），玉米油（索莱宝），蛋白裂解液（碧云天），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），NDUFA13小鼠抗人单克隆抗体（Santa cruz），NLRP3兔抗人多克隆抗体（Bioss），α-SMA 小鼠抗人单克隆抗体（Bioss），Collagen Ⅲ兔抗人多克隆抗体（Bioss），TNF-α小鼠抗人单克隆抗体（Bioss），IL-1β兔抗人多克隆抗体（Bioss），小鼠抗β-actin抗体（Sigma），Western BrightTMECL显色试剂盒（Advansta），山羊抗兔Alexa-Fluor 555荧光二抗（Bioss），山羊抗小鼠Alexa-Fluor 647 荧光二抗（Bioss）。

1.1.3 主要仪器 台式高速离心机（Thermo Fisher Scientific），ChemiDocTMTouch成像系统（Bio-Rad），病理切片仪（Leica），A1R 激光共聚焦显微镜（Nikon），NIS Element离线数据分析工作站（Nikon）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 CCl4诱导肝纤维化小鼠模型的制备：36只BALB/C小鼠（7～8周龄，雌雄各半）被随机分为实验组（CCl4）和对照组（Normal），18只/组，雌雄各半。实验组小鼠腹腔注射0.8 mL/kg CCl4（按1∶4体积比与玉米油混合稀释），对照组小鼠注射等体积玉米油，每周注射2次。分别于第3周、5周和7周后，实验组和对照组各取6只小鼠处死，进行肝脏取材。

腺相关病毒体内干预模型的制备：36只BABL/C小鼠（7～8周龄，雌雄各半）被随机分为实验组（CCl4+AAV-NDU13）和对照组（CCl4+AAV-NC），每组18只，雌雄各半。两组小鼠分别尾静脉注射经PBS稀释的过表达病毒AAV8-TBG-NDUFA13（实验组）和对照病毒AAV8-TBG-NC（对照组），注射剂量为1×1011V.G/100 μL载体/小鼠。在病毒注射10 d后，按照上述肝纤维化诱导方法，对小鼠进行0.8 mL/kg CCl4腹腔注射，每周两次，在CCl4诱导3周、5周和7周后，分别处死对照组和实验组小鼠各6只，进行肝脏取材。

1.2.2 组织病理学分析 获取的小鼠肝组织经4%多聚甲醛固定，脱水石蜡包埋制成4 μm石蜡切片，经脱蜡水化等前处理后，分别按照试剂盒说明书进行苏木素-伊红染色和马松染色。最后经过脱水透明并封固，用于镜下观察取图，每组小鼠取10个高倍视野（×400），进行Ishak纤维化评分分析［10］。

1.2.3 Western blotting检测 称取50 mg各组小鼠肝组织，采用蛋白提取试剂盒提取全蛋白，再通过BCA蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度，加入5×SDS PAGE上样缓冲液混匀，100 ℃加热5 min使蛋白变性。采用10%SDS PAGE凝胶电泳，每孔准确加入30 μg总蛋白，再电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，然后放入含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭1 h，加入稀释好的一抗（NDUFA13 1∶300，α-SMA 1∶500，内参为小鼠抗β-actin单克隆抗体1∶7000），4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，加入相应二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀释），室温下孵育1 h，TBST再次洗膜，最后采用ECL显色剂显影，在全自动化学发光成像分析系统中检测和成像，并通过Image J软件对条带进行灰度值分析，计算目标蛋白条带灰度与内参条带灰度之间的比值，即代表目标蛋白的相对含量［10］。

1.2.4 免疫荧光染色 取各组小鼠新鲜肝脏组织，经过OCT快速冷冻包埋，在冰冻切片机中制成8 μm冰冻切片，立即置于4%多聚甲醛溶液固定0.5 h。免疫组化笔画圈并置入PBS 漂洗后，利用山羊血清在室温下封闭1 h，甩干后滴加稀释好的一抗溶液（NDUFA13 1∶50，NLRP3 1∶200，TNF-α 1∶200，IL-1β 1∶200，α-SMA 1∶500，Collagen III 1∶200），置于4 ℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤后，滴加相应二抗溶液，并于室温下孵育1 h，再次PBS洗涤后，通过DAPI溶液复染细胞核，最后采用抗荧光淬灭封片剂封片，用于激光共聚焦检测成像。每组选取10个高倍视野（×400），进行平均荧光强度分析（MFI）。

1.2.5 统计学分析 所有实验独立重复3次，数据以均数±标准差表示。采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 18.0统计软件进行数据分析，两组间差异行独立样本t检验，多组间行单因素方差分析，Ρ＜0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCl4处理对小鼠肝脏中NDUFA13蛋白表达的影响

2.1.1 CCl4诱导小鼠肝损伤和肝纤维化模型的建立与分析 HE染色和Masson染色评价CCl4诱导的小鼠肝损伤及肝纤维化程度。结果显示，CCl4处理小鼠肝组织肝小叶结构排列紊乱，肝细胞变性坏死，炎症细胞募集且伴大量胶原蛋白沉积，从肝小叶中央区逐步向外周发生纤维化。并且随着时间推移，炎症浸润和纤维化程度进一步加重（Ρ＜0.001，图1A、B）。Western blotting检测结果发现，相比正常对照组，CCl4诱导小鼠肝组织中肝星状细胞活化标志物α-SMA蛋白表达水平在各时间段均明显增加（Ρ＜0.01，图1C）。

图1 HE染色、Masson染色检测小鼠肝组织损伤及纤维化情况Fig.1 Pathological and fibrotic changes in the liver tissues of CCl4-treated mice (HE and Masson staining,Original magnification: ×400).A: HE staining of the liver tissues of CCl4-treated mice. B: Masson staining of the liver tissues.Ishak score was used to evaluate histological grading and staging of liver fibrosis.C:α-SMAprotein expression in the liver tissues of CCl4-treated mice detected by Western blotting.Relative density of α-SMA expression was shown.**P＜0.01,***P＜0.001 vs normal.

2.1.2 CCl4模型小鼠肝脏中NDUFA13 蛋白表达情况将上述CCl4连续诱导3、5、7 周的肝脏组织用于NDUFA13蛋白检测。结果显示，相比健康的非纤维化对照组，CCl4处理使得肝组织中NDUFA13蛋白表达显著降低（Ρ＜0.001，图2）。

图2 CCl4处理小鼠肝脏中NDUFA13蛋白表达检测Fig.2 NDUFA13 protein expression in the liver tissues of CCl4-treated mice detected by Western blotting.A:Western blots of protein.B:Relative of protein expression.***P＜0.001 vs normal.

2.2 NDUFA13蛋白过表达可减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化

2.2.1 AAV8介导肝细胞过表达NDUFA13蛋白的CCl4诱导鼠模型 通过AAV8-TBG病毒介导肝细胞特异性NDUFA13过表达，观察其对CCl4诱导的肝纤维化病理进程的影响（图3A）。通过Western blotting 验证NDUFA13蛋白过表达的体内效率，结果显示在CCl4处理3、5、7周后，相比CCl4+AAV-NC对照组，CCl4+AAVNDU13干预组小鼠肝组织中NDUFA13 蛋白的表达明显增加（Ρ＜0.05，图3B）。

图3 AAV8介导肝细胞过表达NDUFA13蛋白的CCl4诱导鼠模型Fig.3 Hepatocyte-specific NDUFA13 overexpression mediated by AAV8 in CCl4-treated mice.A:Schematic diagram of AAV8 virus-mediated hepatocyte-specific NDUFA13 overexpression in CCl4-treated mice.B:NDUFA13 expression after AAV8 virus treatment detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01 vsAAV-NC.

2.2.2 NDUFA13蛋白过表达对CCl4诱导小鼠肝纤维化的影响 HE染色和Masson染色分析NDUFA13蛋白过表达的CCl4诱导小鼠肝组织损伤和肝纤维化情况。结果显示，在CCl4干预后，AAV-NC组小鼠肝脏内肝细胞坏死，炎症细胞浸润和胶原纤维沉积显著，而AAVNDU13组小鼠肝组织炎症损伤和纤维化改变明显减轻（Ρ＜0.001，图4A～C）。

图4 NDUFA13蛋白过表达对CCl4小鼠肝组织病理学的影响Fig.4 Effect of NDUFA13 overexpression on liver histopathology in CCl4-treated mice(×400).A:HE staining of the liver tissues of CCl4-treated mice with NDUFA13 overexpression. B: Masson trichrome staining for liver fibrosis.C:Ishak scores for histological grading and staging for fibrosis.***P＜0.001 vsAAV-NC.

2.3 NDUFA13蛋白过表达抑制肝组织中NLRP3活化

各组小鼠肝组织冰冻切片用于抗NDUFA13和抗NLRP3-CIAS免疫荧光双标检测。结果显示，相比正常对照组，CCl4组肝脏NDUFA13蛋白表达显著降低，且肝细胞中炎症小体NLRP3蛋白聚集明显增多（Ρ＜0.001，图5）。而经AAV8病毒干预的CCl4模型鼠，NDUFA13过表达组相比NC组的NLRP3表达显著减少（Ρ＜0.001，图5）。

图5 NDUFA13蛋白过表达对NLRP3活化的影响Fig.5 Effect of NDUFA13 overexpression on activation of NLRP3 in CCl4-treated mice. A: Dual immunofluorescence staining of NDUFA13 and NLRP3 in the liver tissues of CCl4-treated mice(×400).Green: NDUFA13;Red: NLRP3;Blue: Nucleus. B:Mean fluorescent intensity for quantifying protein expressions.***P＜0.001.

2.4 NDUFA13蛋白过表达减少肝组织中炎症因子分泌

各组小鼠肝组织冰冻切片用于抗IL-1β和抗TNF-α免疫荧光双标检测。结果发现，相比正常对照组，CCl4组小鼠肝脏中炎性细胞因子IL-1β、TNF-α分泌均显著增加（Ρ＜0.001，图6）。而相比AAV-NC组，AAV-NDU13组小鼠经CCl4诱导后IL-1β、TNF-α释放明显减少（Ρ＜0.001，图6）。

图6 NDUFA13蛋白过表达对IL-1β和TNF-α的影响Fig.6 Effect of NDUFA13 overexpression on secretion of IL-1β and TNF-α in CCl4-treated mice. A: Dual immunofluorescence staining staining of IL-1β and TNFα in the liver of CCl4-treated mice(×400).Green:TNF-α;Red:IL-1β;Blue:Nucleus.B:Mean fluorescent intensity for quantifying protein expressions.***P＜0.001.

2.5 NDUFA13蛋白过表达减弱HSC活化与胶原生成

小鼠肝组织用于Western blotting检测肝星状细胞活化标志物α-SMA的表达水平，并通过免疫荧光分析其胶原合成情况。结果显示，相比AAV-NC 干预组，AAV-NDU13过表达组小鼠肝脏α-SMA表达在CCl4处理3周、7周均出现明显减弱（Ρ＜0.05，图7A），且其胶原合成也受到显著抑制（Ρ＜0.001，图7B）。

图7 NDUFA13蛋白过表达对HSC活化及其胶原生成的影响Fig.7 Effect of NDUFA13 overexpression on HSCs activation and collagen production in the liver of CCl4-treated mice.A:α-SMA protein expression in CCl4 mouse liver with AAV8 intervention detected by Western blotting.B:Dual immunofluorescence staining of α-SMA and collagen Ⅲin CCl4-treated mouse liver tissues(×400).Green: α-SMA;Red: Collagen-Ⅲ;Blue: Nucleus.Mean fluorescent intensity (MFI) for quantifying protein expressions.Representative images are shown.*P＜0.05,***P＜0.001 vs normal orAAV-NC.

3 讨论

肝脏是人体重要的消化和解毒器官，其代谢异常可诱发肝脏炎症、肝硬化甚至肝癌［17］。其中，肝纤维化则是慢性肝损伤恶性转变的重要节点［18］，能否在肝纤维化或肝硬化早期进行有效干预成为疾病逆转的关键。因此，抗肝纤维化靶点或药物的探究，仍然是相关疾病临床治疗的迫切需求。目前研究多关注于肝星状细胞（HSCs）、肝巨噬细胞等与肝纤维化的关系［19,20］，而肝实质细胞作为病理损伤的主要靶细胞，其受损才是肝脏炎症病理改变的起始事件，也是HSCs活化的主要诱因。我们通过建立CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，从分子水平探究肝纤维化进程中肝细胞的改变，寻求改善肝细胞内稳态的可能靶点，对肝纤维化的早期预防和治疗具有重要意义。

CCl4暴露诱导的急性肝损伤模型，可模拟人类肝纤维化疾病状态，常被用于肝脏毒理解析和潜在保护剂的探究［21,22］。CCl4进入机体后可通过肝脏细胞色素P450代谢产生氧自由基，结合肝细胞线粒体的磷脂分子发生氧化反应而影响其呼吸功能，使得ATP减少和ROS释放增加，最终导致肝细胞氧化应激损伤［23］。虽然肝损伤机制复杂多样，但肝细胞线粒体氧化损伤是许多药物肝毒性或慢性肝脏疾病的重要机理之一。NDUFA13蛋白是线粒体呼吸链复合物Ⅰ的关键组分，对于线粒体膜电位维持、线粒体ROS产生至关重要，近年又作为一种潜在抑癌基因被报道［8］。此外，我们前期研究揭示了肝细胞NDUFA13杂合敲除可诱导小鼠自发性肝炎和肝纤维化表型［9,10］。本研究发现CCl4处理使得线粒体NDUFA13蛋白表达显著降低，而NDUFA13蛋白过表达可显著抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化。这就充分揭示了NDUFA13蛋白可作为抗纤维化的靶标，发挥对肝脏稳态的保护作用。

NLRP3属目前研究最广泛的一类炎症小体，是炎症性疾病中由细胞内模式识别受体（PRRs）参与组装形成的一类多蛋白复合体，主要包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和丝氨酸蛋白酶（caspase-1）［11,12］。NLRP3炎症小体受多种信号调控被激活，是肝脏炎症与肝纤维化病理进程的关键信号分子［12］。相关文献表明，NLRP3炎症小体组分可进入HSCs胞内调节其活化，促进胶原纤维的沉积［24］。此外，NLRP3 可通过caspase-1依赖性方式剪切释放成熟的IL-1β、IL-18及IL-33等活性炎症因子，进一步活化HSCs，加速肝纤维化进程［11］。在非酒精性脂肪肝小鼠模型中，NLRP3活化是肝纤维化进展的重要前提［25］；而NLRP3抑制可显著减轻实验小鼠的肝炎和肝纤维化表型［14］。在肝细胞特异性NDUFA13敲除鼠中，我们亦观察到NLRP3炎症小体的显著活化［9］。与这些结果相一致的是，CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝脏组织中NDUFA13蛋白表达降低而NLRP3聚集增多，而NDUFA13蛋白过表达可显著降低NLRP3表达水平。这表明NDUFA13蛋白可能通过抑制NLRP3活化减轻CCl4诱导的肝损伤和肝纤维化。

作为一个多细胞、多因子参与的持续性炎症反应过程，炎症相关信号的激活则是诱导肝纤维化发生发展的关键。IL-1β作为IL-1家族重要成员，可通过自分泌或旁分泌的方式进行双向反馈调节，一方面促进HSCs持续活化和增殖并合成ECM，另一方面上调金属基质蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）表达而抑制ECM降解，加重肝脏炎症及肝纤维化程度［26］。TNF-α主要由淋巴细胞及巨噬细胞合成，可加速HSCs增殖与促进胶原合成，并介导IL-6、IL-8等其他炎性因子生成，临床上常使肝纤维化进行性加重并向肝硬化进展［27］。此外，临床研究表明患者血清中IL-1β、TNF-α含量与其肝纤维化程度有着紧密联系［28］。我们的研究也证实了，CCl4处理的小鼠肝脏IL-1β与TNF-α分泌明显增多，而NDUFA13蛋白过表达显著抑制了IL-1β与TNF-α表达水平。这可能解释了NDUFA13蛋白经NLRP3炎症信号调控抑制的HSCs活化及胶原合成。

综上所述，NDUFA13蛋白过表达可减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化，其可能机制涉及NLRP3介导的炎症因子调控，但具体的调控路径还有待后续进一步探究。本研究揭示了肝细胞NDUFA13作为抗肝纤维化靶点的可能作用，为相关疾病的临床治疗提供新思路。