锁阳中19种无机元素的NIR快速测定模型的建立与适宜测定元素筛选

顾志荣，祁 梅，杨 浩，郭 燕，葛 斌*

（1.甘肃省人民医院 药剂科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730000）

锁阳是重要的中药及蒙药，也是功能保健食品原料，来源于锁阳科（Cynomoriaceae）植物锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉质茎［1］。锁阳是一种沙漠寄生植物，多寄生于蒺藜科白刺属植物根部，主要产于内蒙古、甘肃、新疆以及青海等西北沙漠地带［2］。锁阳含有丰富的治疗性及保健性成分（包括黄酮类、多糖类、多酚类、三萜类、氨基酸以及矿质元素［3-6］等），具有调节性激素水平［7］、促进生殖功能［8］、降血糖［9］、抗氧化损伤［10］以及抗肿瘤［11］等功效。锁阳同时含有丰富的矿质元素及重金属、有害元素，对人体补充矿质元素具有很大的益处，但同时存在着引起重金属及有害元素蓄积中毒的可能。

本研究组前期建立了锁阳中19 种无机元素的电感耦合等离子体-质谱（Inductively coupled plasma - mass spectrometry，ICP - MS）测定方法［12］，并对Pb、Cd、Cr、As、Hg、Cu 等重金属及有害元素的超标情况进行了研究，发现个别产地的样品存在超标情况；同时分析了锁阳中重金属及有害元素的污染情况，并评估健康风险，结果提示锁阳中As、Pb、Cr及重金属总含量存在一定风险，对人体有一定的非致癌作用［13］。

近红外光谱（Near-infrared spectroscopy，NIR）定量测定技术是近年来新兴的快速、绿色测定技术，已广泛用于农业［14］、工业［15］、食品［16］以及制药［17］等各领域，具有检测速度快、检测效率高、样品前处理简单、可同时测定多成分等优点。该法传统仅应用于有机成分测定，无机元素较少涉及，这是因为NIR 的主要信息来源是有机物的C - H、O - H、N -H、S - H 等分子振动，而无机元素在近红外区没有吸收，因此无法直接测定。但药用植物中的无机元素不是以单一离子形态存在，而是与蛋白质、氨基酸、淀粉、有机酸等结合形成络合物或螯合物，进而能够间接地在近红外区产生吸收峰，或无机元素含量与样品中某些有机组分含量之间存在相关关系，因此利用这种络合关系或含量相关关系，可间接采用NIR 技术快速测定无机元素含量［18-19］。目前，采用NIR 技术快速测定中药中无机元素含量未见相关报道，在农业领域已用于快速测定棉籽［18］以及稻米［14］等的无机元素含量。

本研究首次尝试建立锁阳中19 种无机元素含量的NIR 快速测定模型，筛选适宜采用NIR 技术进行测定的元素，为锁阳无机元素测定提供了一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

82批锁阳样品分别采集于甘肃（32批）、内蒙古（17 批）、新疆（12 批）、青海（12 批）、宁夏（9 批）等5个省（区），所有样品均经甘肃中医药大学中药鉴定教研室李硕副教授鉴定为锁阳（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉质茎。将样品自然阴干，粉碎后过80 目筛，冷藏备用。Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Co、Sr、Ni、Ag、Ba、Ti、Pb、Cr、Cd、As、Hg、Cu 单元素标准溶液浓度为1 000 μg/mL，购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；Ge、In、Bi、Sc 单元素内标液浓度为10 μg/mL，购自SPEX CertiPrep 公司；柑橘叶成分分析标准物质（批号GBW10020）购自中国地球物理化学勘察研究所；HNO3、H2O2为优级纯，水为去离子水。

1.2 主要仪器

Nicolet - 6700 型傅立叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；iCAP RQ 型电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）仪（美国Thermo Fisher 公司）；ETHOS 900微波消解系统（意大利Milestone公司）；Milli - Q 超纯水装置（法国Millipore 公司），电阻率≥ 18.2 MΩ/cm；Sartorius BT 125D 万分之一电子天平（德国Sartorius 集团）；DZF - 6090 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。无机元素测定所用玻璃仪器均以浓硫酸浸泡过夜，再以去离子水彻底冲洗备用。

1.3 NIR光谱采集

开启NIR 仪，预热半小时，采用积分球漫反射方式采集原始光谱。将样品粉末于60℃干燥至恒重，混匀，置于旋转杯内压实，以内置背景为参比，扫描范围10 000 ~ 4 000 cm-1，扫描64 次，分辨率8 cm-1，温度（25 ± 0.5）℃，相对湿度20% ~ 30%，每批样品重复采集3次，取平均光谱。

1.4 ICP - MS测定19种无机元素化学参考值

ICP - MS 工作条件［12］为：等离子体射频功率1 300 W；雾化气（氩气）流量、辅助气流量、等离子流分别为1.1、1.0、15.0 L/min；雾化室为石英双通道，温度2℃；采样锥孔径、截取锥孔径、采样深度分别为1.1、0.4、7.0 mm；脉冲电压1 050 V；蠕动泵转数40 r/min；炬管为石英一体化，2.5 mm 中心通道；驻留时间30 ms；动能歧视（Kinetic energy discrimination，KED）电压3 V。Na、K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Sr、Ni、Ti、As 采用Ge 作为内标，Ag、Ba、Pb、Hg、Cd 采用In 作为内标。重复测定3 次，取平均值。方法学考察表明，本方法满足实验要求。

1.5 建模光谱波段的选择

采用TQ Analyst 8.0 定量分析软件的自动优化功能筛选最佳建模光谱波段。

1.6 光谱预处理方法的选择

以决定系数R2、校正均方差（RMSEC）、预测均方差（RMSEP）和留一法交叉验证均方差（RMSECV）为衡量指标，考察未处理光谱（None）、标准正态变量校正（SNV）、多元散射校正（MSC）、一阶导数（FD）、二阶导数（SD）和移动窗口最小二乘多项式平滑（SG）等常见光谱预处理方法及组合方法，筛选最佳光谱预处理方法。

1.7 因子数的选择

以RMSECV及决定系数R2为考察指标，以内部交互验证法筛选19种无机元素的最佳模型因子数。

2 结果与分析

2.1 NIR光谱

82批锁阳样品的NIR叠加见图1。

图1 锁阳近红外光谱图Fig.1 NIR spectra of Cynomorii Herba

2.2 样品集划分与化学参考值分布

Dixon检验表明82批样品均无异常光谱。随机抽取57批（占样品总数的70%）作为校正集，其余25批（占样品总数的30%）作为验证集。各元素在样品集中的含量分布见表1。可以看出，各元素含量在样品集中的分布范围较广，代表性良好，满足模型建立要求。

表1 样品集划分及化学参考值分布Tab. 1 Results of sample set partitioning and chemical reference distribution

2.3 偏最小二乘法（PLS）定量模型的建立与评价

优化得到锁阳中19 种无机元素的最佳建模光谱波段、光谱预处理方法及因子数（见表2）。校正模型的相关性见图2，模型结果见表3。可知，K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 元素的决定系数R2及交叉验证R2均大于0.9，RMSEC、RMSEP 及RMSECV在0.52 ~ 2.20 之间，所建模型的预测值与参考方法测得的真实值之间具有较好的相关性，模型预测性能较好，适宜采用NIR 技术进行快速测定。Ni、Zn元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.8 ~ 0.9 之间，RMSEC、RMSEP及RMSECV在0.49 ~ 1.41之间，预测值与真实值之间的相关性一般。而Cu 元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.7 ~ 0.8 之间，Na、Fe、Ag、Ba、Pb、Cd、As、Hg 元素的决定系数R2及交叉验证R2均小于0.7，此9 种元素的RMSEC、RMSEP 及RMSECV 在1.13 ~ 10.75 之间，预测值与真实值之间的相关性较差，不适宜采用NIR 技术进行快速测定。

2.4 模型的外部验证

选择未参加建模的10批样品输入模型，对适宜采用NIR 技术进行快速测定的K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 等8 种元素的校正模型进行外部验证，以验证集中样品的模型预测值与ICP - MS实测值的比值作为预测回收率，得8种元素的模型预测值和真实值之间的相对误差在0.04% ~ 7.62%之间，平均预测回收率在94.12% ~ 108.45%之间，表明模型预测值与实测值基本相符，百分偏差较小，预测结果较为准确。以各元素的模型预测值与实测值进行配对t检验，结果均为P> 0.05（α= 0.05），预测值与真实值无显著性差异，表明2种检测方法不存在系统误差。因此，利用NIR 技术快速测定锁阳中K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti以及Cr等8种元素的含量是可行的。

3 讨论与结论

3.1 与同类研究比较

矿质元素是锁阳的重要营养物质，目前相关研究较多。采用原子吸收光谱（Atomic absorption spectroscopy，AAS）对锁阳无机元素进行测定的元素种类包括Na、K、Mg、Ca、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Pb、Cr、Cd、Au 以及Ag 等15 种，但不包括本研究中的Sr、Ba、Ti、As以及Hg元素，主要原因是AAS对痕量元素灵敏度及检测限达不到要求而无法同时测定［20］。而ICP - MS 准确度及灵敏性更高，可检测到的锁阳无机元素更多［12］，但存在长时间的样品预处理过程消耗大量HNO3、HF 等腐蚀性强酸，污染环境，危险系数高，对实验操作技术及实验仪器设备质量要求高，仪器设备及检测费用昂贵，操作繁琐，不利于大规模样品测定等诸多不足。NIR快速测定无机元素技术可以解决上述不足，但用于锁阳的无机元素测定尚属空白。

3.2 NIR适宜测定的元素分析

由表3 可知，不是每一种锁阳中的无机元素含量都适宜采用NIR 技术进行快速测定。K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti、Cr 等8 种元素的相关性与模型预测性能均较好，适宜采用NIR 技术进行快速测定。而Ni、Zn 元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.8 ~ 0.9之间，相关性一般，因此需要进一步增大样本量，对模型进行优化，以提高预测精度。Cu元素的决定系数R2及交叉验证R2在0.7 ~ 0.8 之间，而Na、Fe、Ag、Ba、Pb、Cd、As、Hg元素的决定系数R2及交叉验证R2均小于0.7，此9 种元素的预测值与真实值之间相关性较差，不适宜采用NIR 技术进行快速测定，可能是因为这些元素没有很好地与有机物相络合，因此光谱信息不能被间接采集。

3.3 “共线性”现象分析

Hg 元素实测值与PLS 模型预测值存在“共线性”现象，这是因为在锁阳中Hg 含量极低，样品集浓度跨幅较小，浓度集中在较小范围，加之化学参考值有效数字保留问题，导致许多样品的化学参考值相同而在相关图显示“共线性”，因此Hg 不宜使用NIR快速测定。

3.4 研究结论与局限性

采用NIR 技术快速测定无机元素含量，与被检测对象的化学成分密切相关，因此对于不同药物、不同元素不可一概而论。本研究表明，利用NIR 技术快速测定锁阳中K、Ca、Mg、Mn、Co、Sr、Ti以及Cr等8 种元素的含量是可行的，对其他元素则检测准确度不足。总体来讲，因为是利用中药中无机元素离子与有机成分的络合关系或含量相关关系进行间接检测，因此即使对于适宜采用NIR 技术进行快速测定的元素，其决定系数R2及交叉验证R2也未完全达到100%，RMSEC、RMSEP 及RMSECV 总体偏大，与检测有机成分相比，模型相关性及预测能力并不完美，但误差仍在可接受范围内。